简介:摘要外泌体是一种直径为30~150 nm的膜性小囊泡,由细胞内多囊泡出芽形成,可与细胞膜融合释放至细胞外基质中。脂肪源性间充质干细胞(ADSC)是具有自我更新及多向分化潜能的细胞,通过旁分泌外泌体的作用转运活性物质,调控机体炎症反应,细胞的迁移、增殖、分化以及血管的生成等,从而增强创面修复能力,促进创面愈合,抑制瘢痕形成。慢性创面是指无法通过正常有序而及时的修复过程达到解剖和功能上的完整状态,病程超过4周的创面。当前针对慢性创面的治疗方法多种多样,其中ADSC具有良好的应用前景,但因伦理问题,存在一定的局限性,而外泌体可避开这个问题。本文就ADSC外泌体治疗慢性创面进行综述。
简介:目的观察外胚间充质干细胞(EMSCs)在大鼠胶质瘤模型中枢神经系统(CNS)内的分化方向。方法将大鼠c6胶质瘤细胞系微量注射入12只SD大鼠(4~6周龄)右侧纹状体内,建立大鼠胶质瘤模型;C6细胞移植后2d,Hoechst33342标记EMSCs移植到SD大鼠双侧纹状体内。EMSCs移植后7d行全脑组织冰冻切片,免疫荧光染色观察细胞表面标记OX-42(CD11b/CD11a)的表达,荧光显微镜下观察标记效果。结果SD大鼠全脑组织切片观察证实12只大鼠脑胶质瘤模型建立成功;Hoechst33342标记EMSCs阳性率达95%以上;荧光显微镜镜下观察显示注射人大鼠体内的EMSCs经过7d后大部分细胞都保持存活状态。同时有V6细胞和EMSCs存在的时候,C6细胞周围存在大量OX-42阳性细胞;而只有c6细胞或只有EMSCs时,OX-42阳性的细胞数量非常少。另外,远离c6细胞的EMSCs具有向c6细胞迁移的特性。结论在SD大鼠胶质瘤模型纹状体内中,EMSCs大多数被C6细胞诱导成为具有吞噬和抗原提呈功能的小胶质细胞。
简介:背景:间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下,可分化为软骨、肌肉、肌腱等。间充质干细胞进行的临床试验主要包括组织损伤修复,如骨、软骨、关节损伤的修复,心脏、肝脏、脊髓损伤和神经系统疾病的治疗。目的:比较各种来源的间充质干细胞的生物学特性。方法:检索1987到2015年PubMed数据库和中国知网数据库收录的与间充质干细胞来源,间充质干细胞生物学特性相关的文献。从细胞表面标记物,增殖、分化、迁移能力,以及功能方面进行分析总结,探讨了各种来源的间充质干细胞的优缺点。结果与结论:不同来源的间充质干细胞的增殖潜力和表面标记物存在差异。不同组织来源的间充质干细胞免疫活性可能与间充质干细胞处于不同组织中的活化状态、种属差异、组织来源和培养条件的不同有关,从而导致不同源性间充干细胞免疫活性也不完全相同。深入认识影响不同组织来源间充质干细胞迁移的因素和机制,可以增强不同源性间充质干细胞靶向迁移的能力,提高其在创伤愈合、组织修复和再生中的治疗效率。
简介:摘要目的探讨低氧对人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)及其细胞外囊泡(EVs)生成的影响,初步阐述其调控机制。方法分离培养原代hUCMSCs,将其分为常氧组和低氧组,分别在常氧(21%O2)和低氧(5%O2)培养箱中培养,用细胞计数试剂盒(CCK-8)检测细胞增殖,提取hUCMSCs生成的EVs,利用透射电子显微镜(TEM)和纳米颗粒示踪分析(NTA)进行鉴定,蛋白质印迹法(Western blot)检测EVs膜标志蛋白CD9和CD63表达,转录组高通量测序分析低氧对hUCMSCs表达谱的影响,Western blot分析细胞内缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)、丝氨酸/苏氨酸激酶(Akt)和磷酸化丝氨酸/苏氨酸激酶(p-Akt)、以及磷酸化40×103大小的富含脯氨酸的Akt底物(p-PRAS40)的表达水平。两组间采用t检验进行统计分析。结果低氧处理hUCMSCs 24 h后,CCK-8结果显示低氧组吸光度值(2.151±0.116)高于常氧组(1.929±0.145),差异有统计学意义(t=2.659,P<0.05);NTA检测结果显示低氧组EVs颗粒浓度[(13.714±1.704)×109/ml]高于常氧组[(1.271±0.573)×109/ml],差异有统计学意义(t=18.310,P<0.05);低氧组EVs蛋白浓度(2.743±1.013)高于常氧组(0.403±0.303),差异有统计学意义(t=3.831,P<0.05);Western blot结果显示低氧组EVs的CD9、CD63表达水平(4.092±1.711、1 162.225±573.901)高于常氧组(1±0,t=3.005、3.505,P<0.05)。转录组高通量测序分析显示有1 429个基因存在显著表达差异,且主要富集于细胞因子相关通路。Western blot结果显示低氧组HIF-1α、Akt、p-Akt、p-Akt/Akt,以及p-PRAS40的表达水平(2.593±0.556、1.395±0.044、2.586±0.130、1.953±0.104、2.131±0.572)均高于常氧组(1±0),差异有统计学意义(t=3.098、4.246、4.059、3.149、2.799,P<0.05)。结论低氧可通过激活HIF-1α和磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/Akt信号通路促进hUCMSCs增殖和EVs生成。
简介:摘要目的探讨人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,HUCMSCs)外泌体对创伤性脑损伤(traumatic brain injury,TBI)后神经保护的作用及可能机制。方法分离、培养HUMSCs并提取外泌体,使用透射电镜和蛋白免疫印迹方法进行外泌体鉴定;将60只健康雄性SPF级SD大鼠按照随机数字表法分为3组,分别为假手术组(n=20)、TBI对照组(n=20)、外泌体治疗组(n=20),采用电子脑皮质损伤撞击仪建立大鼠TBI模型,采用改良神经功能缺损评分(modified neurological severity score,mNSS)和Morris水迷宫实验(Morris water maze,MWM)评估大鼠的神经功能运动和空间记忆功能,使用免疫荧光法检测胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)和小胶质细胞特异性蛋白离子钙结合衔接分子1(ionized calcium binding adaptor molecule-1,IBA1)活化表达水平。TUNEL检测大脑皮质损伤区细胞凋亡的变化。所有的数据采用SPSS 22.0软件进行统计分析,两组间比较采用t检验,多组均数的比较采用单因素方差分析,双因素方差分析进行神经行为学统计。结果相差显微镜下,HUCMSCs的外泌体直径为40~120 nm,呈圆形,荧光显微镜下显示标记的外泌体CD9、CD63蛋白表达阳性。与TBI组相比,外泌体治疗组mNSS评分[术后28 d(3.23±0.72)分]较TBI组[术后28 d(5.14±0.96)分]明显降低(t=3.559,P<0.01);水迷宫实验结果显示,术后第26天外泌体治疗组的逃避潜伏期[(21.25±4.72)s]较TBI组[(33.06±8.81)s]变短(t=3.737,P<0.01),外泌体治疗组穿越平台次数[(3.56±0.48)次]与TBI组[(2.06±0.36)次]相比明显增加(t=7.906,P<0.01),经过外泌体治疗后,大鼠的运动功能和空间记忆功能明显改善;免疫荧光显示,TBI组与假手术组相比GFAP和IBA1表达量明显增高,外泌体治疗组与TBI组相比明显降低;TUNEL染色结果显示TBI组大脑皮质TUNEL阳性细胞数较假手术组明显增多(P<0.01),给予外泌体治疗后,TUNEL阳性细胞的数量较TBI组明显减少(P<0.01)。结论HUCMSCs外泌体在脑外伤后可促进神经功能恢复,抑制胶质细胞过度活化,保护神经元细胞,并减少细胞凋亡。
简介:摘要目的观察骨髓间充质干细胞(BMSC)来源的外泌体上miR-183、视网膜脱氢酶11(RDH11)的表达,初步探讨两者靶向关系以及对视网膜色素上皮(RPE)细胞的影响。方法分离培养C57BL/6(C57)小鼠BMSC,鉴定BMSC来源的外泌体。将BMSC分为空白组、模拟空白对照组(mimic-NC组)、miR-183模拟组(miR-183-mimic组)。参照文献方法培养C57小鼠、视网膜变性10(rd10)小鼠RPE细胞。来自rd10小鼠的RPE细胞转染BMSC外泌体并共培养后分为对照组、外泌体组、mimic-NC-外泌体组(mimic-NC-exo组)、miR-183-mimic-外泌体组(miR-183-mimic-exo组)。采用实时荧光定量聚合酶链反应、蛋白免疫印迹法检测C57小鼠、rd10小鼠以及各组RPE细胞中miR-183、RDH11 mRNA和蛋白相对表达量。生物信息学网站及双荧光素酶报告分析miR-183与RDH11的靶向关系。细胞计数试剂盒8检测BMSC外泌体上miR-183对RPE细胞增生的影响;原位末端标记法检测RPE细胞凋亡情况。多组间比较采用单因素方差分析。结果与C57小鼠比较,rd10小鼠RPE中miR-183相对表达量下调,RDH11 mRNA相对表达量上调,差异均有统计学意义(t=5.230、8.548,P=0.006、0.001)。与空白组、mimic-NC组比较,miR-183-mimic组外泌体中miR-183 mRNA相对表达量显著上升(F=60.130,P<0.05)。共培养24 h时,外泌体进入RPE细胞。与mimic-NC-exo组比较,miR-183-mimic-exo组RPE细胞中miR-183 mRNA相对表达量显著升高(t=7.311,P=0.002),细胞增生能力增强(F=10.949,P=0.012)、凋亡数量减少(t=4.571,P=0.002),差异均有统计学意义。生物信息学网站及双荧光素酶报告证实miR-183与RDH11具有靶向关系。与mimic-NC组比较,miR-183-mimic组外泌体中RDH11 mRNA及蛋白相对表达量均降低,差异有统计学意义(t=5.361、6.591,P=0.006、0.003)。共培养后,与对照组比较,外泌体组RPE细胞中RDH11 mRNA及蛋白相对表达量差异无统计学意义(t=0.169、1.134,P=0.874、0.320);与mimic-NC-exo组比较,miR-183-mimic-exo组RPE细胞中RDH11 mRNA及蛋白相对表达量均降低,差异有统计学意义(t=5.554、5.546,P=0.005、0.005)。结论上调BMSC来源的外泌体miR-183通过靶向抑制RDH11的表达促进RPE细胞体外增生,减少细胞凋亡数量。
简介:摘要目的探讨肝细胞生长因子(HGF)修饰的人脂肪间充质干细胞(ADSC)外泌体对糖尿病小鼠全层皮肤缺损创面的作用及其机制。方法采用实验研究方法。取2021年2—5月于空军军医大学第一附属医院整形科行腹部手术的3名健康女性(10~25岁)废弃脂肪组织,采用胶原酶消化法获取原代ADSC,培养7 d,用倒置相差显微镜观察细胞形态。取第3代ADSC,转染HGF慢病毒,培养5 d,采用成像系统观察细胞荧光情况并计算转染率。取第3~6代ADSC和第3~6代转染HGF的ADSC,均分别采用密度梯度离心法提取其外泌体,即为ADSC外泌体和HGF-ADSC外泌体。采用透射电子显微镜观察外泌体微观形态,采用流式细胞仪检测外泌体的CD9、CD63、CD81阳性表达。取24只6周龄雄性昆明小鼠,制作糖尿病模型后,在其背部制作全层皮肤缺损创面。按照随机数字表法将小鼠分为磷酸盐缓冲液(PBS)组、单纯HGF组、单纯ADSC外泌体组和HGF-ADSC外泌体组,每组6只,分别作相应处理。伤后3、7、10、14 d,观察创面愈合情况并计算其愈合率,使用多普勒血流仪检测创基血流强度并计算伤后10 d创基相对血流强度百分比。伤后10 d,采用免疫荧光法检测创面中Ki67阳性细胞数,采用免疫组织化学法检测创面中CD31阳性染色且成管样结构的新生血管数,采用蛋白质印迹法检测创面中内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、磷酸化PI3K(p-PI3K)、蛋白激酶B(Akt)、磷酸化Akt(p-Akt)的蛋白表达并计算p-PI3K与PI3K比值及p-Akt与Akt比值。伤后14 d,采用苏木精-伊红染色法、Masson染色法分别检测创面皮肤组织缺损长度及胶原新生情况,并计算胶原容积分数(CVF)。样本数均为3。对数据行重复测量方差分析、单因素方差分析及Tukey检验。结果原代ADSC培养7 d,细胞呈梭形,生长密集后呈旋涡状排列。培养5 d后,第3代转染HGF的ADSC携带绿色荧光,转染率为85%。ADSC外泌体及HGF-ADSC外泌体微观形态相似,均呈囊泡状结构,平均粒径分别为103、98 nm,均呈CD9、CD63、CD81阳性。伤后3 d,4组小鼠创面的创周均红肿且有少量渗液;伤后7 d,HGF-ADSC外泌体组创面逐渐缩小,其余3组创面缩小不明显;伤后10 d,4组创面均缩小、结痂;伤后14 d,HGF-ADSC外泌体组创面基本愈合,其余3组均有残余创面。伤后3 d,4组创面愈合率接近(P>0.05);伤后7、10 d,HGF-ADSC外泌体组创面愈合率均分别明显高于PBS组、单纯HGF组及单纯ADSC外泌体组(q值分别为13.11、13.11、11.89,12.85、11.28、7.74,P<0.01);伤后14 d,HGF-ADSC外泌体组创面愈合率明显高于PBS组、单纯HGF组及单纯ADSC外泌体组(q值分别为15.50、11.64、6.36,P值均<0.01)。伤后3 d,4组小鼠创基均无明显血运;伤后7 d,HGF-ADSC外泌体组创基开始有微血管形成,其余3组创基仅创缘充血;伤后10 d,除PBS组创基仍无明显血运外,其余3组均有微血管形成;伤后14 d,HGF-ADSC外泌体组创基血流信号强于其余3组且分布均匀。伤后10 d,HGF-ADSC外泌体组创基相对血流强度百分比明显高于PBS组、单纯HGF组及单纯ADSC外泌体组(q值分别为23.73、19.32、9.48,P值均<0.01);HGF-ADSC外泌体组创面中Ki67阳性细胞数及新生血管数均明显多于PBS组、单纯HGF组及单纯ADSC外泌体组(q值分别为19.58、18.20、11.04,20.68、13.79、8.12,P<0.01)。伤后10 d,HGF-ADSC外泌体组创面中eNOS蛋白表达水平明显高于PBS组、单纯HGF组及单纯ADSC外泌体组(q值分别为53.23、42.54、26.54,P值均<0.01);HGF-ADSC外泌体组创面中p-PI3K与PI3K的比值及p-Akt与Akt的比值均分别明显高于PBS组、单纯HGF组及单纯ADSC外泌体组(q值分别为16.11、11.78、6.08,65.54、31.63、37.86,P<0.01)。伤后14 d,HGF-ADSC外泌体组创面皮肤中组织缺损长度明显短于PBS组、单纯HGF组及单纯ADSC外泌体组(q值分别为20.51、18.50、11.99,P值均<0.01);HGF-ADSC外泌体组创面中CVF明显高于PBS组、单纯HGF组及单纯ADSC外泌体组(q值分别为31.31、28.52、12.35,P值均<0.01)。结论人HGF-ADSC外泌体可增加创基组织新生血管形成,从而显著促进糖尿病小鼠全层皮肤缺损创面愈合,其机制可能与HGF-ADSC外泌体通过激活PI3K/Akt信号通路从而促进创面中eNOS的表达增高有关。
简介:间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSC)的来源非常广泛。由于不同组织来源的影响,MSC之间都会存在一定的差异。本研究分析比较脐带、脂肪及骨髓组织来源的MSC的基本生物学特性。从脐带、脂肪和骨髓分离培养MSC,在显微镜下观察这3种来源的MSC的形态(UC—MSC,AD—MSC和BM—MSC),用流式细胞术诱导分化试验及定量荧光PCR分别检测UC-MSC,AD-MSC和BM-MSC的免疫表型、分化能力和过氧化物酶增殖激活受体-γ(peroxisomeproliferator—activatedreceptor-1,PPAR-1)mRNA的表达水平。结果表明,UC-MSC、AD-MSC和BM—MSC的形态都是成纤维细胞样;经罗丹明和DAPI染色后,用共聚焦显微镜观察发现它们的细胞形态类似;这三种来源Msc的免疫表型符合Msc的鉴定标准,而且表达水平一致;这三种来源MSC的成骨分化潜能相似,而成脂分化潜能存在较明显的差异,其中AD—MSC成脂能力最强,BM-MSC次之,UC-MSC最差。检测脂肪形成早期起重要作用的过氧化物酶增殖激活受体-γ(PPAR-1)mRNA表达水平在三种来源MSC中的基础表达水平,发现PPAR-γmRNA在AD-MSC中最高,在BM—MSC次之,而在UC—MSC中最低,与成脂能力的表现相一致。这表明三种来源MSC成脂能力存在差异可能与它们PPAR-1的基础表达水平有关。结论:UC—MSC,AD—MSC和BM—MSC的形态类似;免疫表型符合MSC鉴定标准,表达水平一致;成骨分化能力相似,而成脂分化能力不同;PPAR-γmRNA表达水平不一。关于差异的相关机制有待进一步研究。