简介:摘要目的探讨Yes相关蛋白(Yes-associated protein,YAP)在肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)诱导的肠黏膜屏障损伤中的保护作用及潜在的分子机制。方法培养人克隆结肠癌Caco-2细胞14 d体外建立肠黏膜屏障模型,随后转染YAP质粒和对照质粒,24 h后加入TNF-α刺激损伤肠黏膜屏障,48 h后通过细胞计数试剂盒(cell counting kit WST-8,CCK-8)检测肠上皮细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞周期,迁移小室(Transwell)检测细胞迁移能力。结果与正常对照组相比,加入TNF-α刺激后,肠上皮细胞增殖活性明显下降,细胞周期G0/G1期比例增加,S期和G2/M期比例减少,而YAP过表达可抑制TNF-α引起的细胞增殖活性下降,使细胞周期顺利从G0/G1期向S期和G2/M期过渡。Transwell结果表明,正常对照组细胞迁移数目为(172.4±13.1)个细胞,加入TNF-α刺激后,细胞的迁移数目降至(80.4±9.3)个细胞,而预先转染YAP可抑制TNF-α引起的细胞迁移能力下降,细胞迁移数目为(124.2±9.2)个细胞,差异有统计学意义(P<0.01)。结论YAP通过促进肠上皮细胞增殖和迁移从而抑制TNF-α诱导的肠黏膜屏障损伤。
简介:摘要目的探讨腺性肥大乳房乳腺上皮细胞(hMEC-GAHB)的原代培养方法,观察该原代细胞的形态学及生物学特点。方法采用0.25%胰蛋白酶和Ⅰ型胶原酶混合液,结合长时间4 ℃和短时间37 ℃消化,配合低转速离心的方法,从2010年4月至2011年4月华中科技大学同济医学院附属协和医院整形外科手术治疗的10例腺性乳房肥大症患者(M组,实验组)和10例正常体积乳房患者(N组,对照组)的乳腺组织中消化获取乳腺上皮细胞并进行原代培养,评价获取原代细胞的效果,观察各组细胞的形态学特点,采用多抗体免疫细胞化学法(MICC)鉴定原代细胞种属,并采用碘化丙锭(PI)染色法、四甲基偶氮唑盐(MTT)法和流式细胞术等方法对各组细胞的细胞周期和体外增殖及凋亡等生物学特点等进行分析。结果腺性肥大乳房每克乳腺组织可获取细胞数为5×106个,细胞存活率为70%,接种后48 h细胞贴壁率为60%,贴壁细胞活性良好,接种后约72 h胞质展开,约120 h相互融合。细胞增殖明显,未见明显凋亡。hMEC-GAHB与正常体积乳房乳腺上皮细胞在细胞形态学上差异无统计学意义,且正常表达典型的上皮细胞骨架蛋白[CK8、CK14、CK18、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)等]。在含有相同浓度的17β-雌二醇的体外环境中,处于同一时期细胞对数生长期时,hMEC-GAHB组的群体倍增率(PDR)为0.548、1.634、2.062、3.946、5.210、8.700,正常体积乳房组的群体倍增率(PDR)为0.394、1.455、1.820、3.822、4.467、5.213,两者间差异有统计学意义(P<0.05);hMEC-GAHB组和正常体积乳房组的G2/M期与G0/G1期细胞数比值分别为0.45±0.01和0.34±0.01,两者间差异有统计学意义(P<0.05)。结论采用改良的酶消化法可获得较满意的细胞数和细胞活性。hMEC-GAHB具有典型上皮细胞的形态学及生物学特点,在含有雌激素的体外环境中,hMEC-GAHB比较正常体积乳房乳腺上皮细胞具有更强的增殖活力,并具有正常的细胞衰退期。
简介:目的该实验旨在研究急性肺损伤(ALI)时肺泡Ⅱ型上皮细胞(AEC-Ⅱ)超微结构变化和肺组织表面活性蛋白SP-A含量的变化关系,从而探讨ALI的发病机制。方法48只Sprague-Dawley幼鼠被随机分为正常对照组和ALI组。腹腔注射脂多糖(LPS,4mg/kg)建立ALI模型,正常对照组注射等量生理盐水。LPS注射后24,48,72h每亚组各处死8只大鼠。取左肺下肺组织待透射电镜检查。用Westernblot方法测定肺组织SP-A的相对含量。结果ALI24h时,AEC-Ⅱ微绒毛消失。24h及48h时板层小体(lamellarbody,Lb)数量增加,体积增大,密度减低,排空明显增强,呈指环状绕核排列,细胞增生活跃,代谢旺盛。48h时Lb呈巨大空泡样变性。肺组织SP-A含量明显高于对照组(24h时ALI组为6.52±0.62,对照组为5.02±0.35,P〈0.01;48h时ALI组为6.65±0.62,对照组为5.01±0.36,P〈0.01)。72h时Lb破溃,数目明显减少,细胞核形态不规则,部分核边界不清,肺组织SP-A含量下降(ALI组为3.87±0.50,对照组为5.22±0.36,P〈0.01)。结论LPS致幼鼠ALI时AEC-Ⅱ和肺组织SP-A的变化为时间依赖性,随AEC-Ⅱ损伤程度的加重肺组织SP-A由代偿转为失代偿,可能是发生ARDS的重要机制之一。
简介:摘要目的分析喉癌及转移淋巴结的细胞亚群分类及功能,探索上皮细胞向肿瘤细胞演化的轨迹。方法对2019年10月22日至12月16日宁波市医疗中心李惠利医院收治的5例喉癌组织、配对的转移淋巴结及3例癌旁正常组织进行单细胞转录组测序,患者均为男性,年龄53~70岁,使用Seurat软件分析上述组织的细胞亚群,功能富集分析探讨各类细胞亚群的生物学功能。运用拷贝数变异(copy number variation,CNV)情况区分上皮细胞恶性与否,通过拟时序分析揭示正常上皮细胞和肿瘤细胞的演变轨迹,并识别癌变的过渡态细胞。经Seurat软件FindAllMarker函数分析得到过渡态细胞中高表达的基因,并用免疫组化进行验证。结果通过多重质控,共获得66 969个高质量单细胞,分为9个主要细胞簇:上皮细胞、T细胞、B细胞、成纤维细胞、内皮细胞、髓系细胞、肥大细胞、浆细胞样树突状细胞和神经细胞,前5类细胞簇分别有8、6、4、3和2类亚群。4个上皮细胞亚群(C0、C1、C2、C5)来源于肿瘤组织和转移淋巴结,具有较高的CNV水平和肿瘤细胞含量。拟时序分析发现上皮细胞演变轨迹为正常上皮细胞亚群C4向早期癌变细胞群C0转化,C0继续分化为3个主要恶性肿瘤细胞亚群C1、C3和C5。上皮细胞C0可能代表癌变的过渡态细胞群,功能富集于上皮间质转化、血管生成等生物学过程,其高表达萝卜硫素(sulforaphane,SFN)可能与肿瘤发生发展相关。免疫组化验证发现SFN在肿瘤组织和转移淋巴结中高表达,而在癌旁组织中低表达。结论本研究利用单细胞测序技术阐述了喉癌组织及转移淋巴结中细胞和功能的多样性,同时C0在肿瘤细胞演化中起到关键作用。
简介:摘要目的探讨晚期氧化蛋白产物(AOPPs)在小肠上皮细胞的上皮间质转化(EMT)中的作用,为研究炎症性肠病(IBD)患者小肠纤维化的发病机制提供依据。方法体外培养小鼠小肠隐窝上皮细胞IEC-6,采用次氯酸氧化修饰大鼠血清白蛋白(RSA)的方法体外制备AOPPs。将IEC-6细胞分为AOPPs组、RSA组和空白对照组。采用50、100、200、400 μg/ml的AOPPs干预IEC-6细胞作为AOPPs组,50、100、200、400 μg/ml的RSA干预IEC-6细胞作为RSA组,空白对照组不做任何干预。干预24 h后观察细胞形态并采用流式细胞术检测细胞凋亡,统计分析凋亡率最高时AOPPs的浓度。采用该浓度的AOPPs干预IEC-6细胞,流式细胞术检测48、72 h的细胞凋亡并统计分析不同时间点凋亡率的差异。荧光定量PCR检测AOPPs组、RSA组和空白对照组E-cadherin、纤维连接蛋白(Fibronectin)及参与调节细胞EMT过程的转录因子Snail、Slug的mRNA表达以及细胞外基质胶原蛋白Ⅰ(CollagenⅠ)的mRNA表达。结果AOPPs可以诱导IEC-6细胞的凋亡,并具有时间及浓度依赖效应(P<0.05);400 μg/ml的AOPPs干预72 h细胞的凋亡率最高,达到(17.30 ± 1.03)%。AOPPs明显下调IEC-6细胞E-cadherin的mRNA表达,而明显上调Fibronectin及Collagen Ⅰ的mRNA表达,同时转录因子Snail和Slug mRNA表达也明显增加(均P<0.05)。结论AOPPs通过诱导小肠上皮细胞凋亡,上调细胞的转录因子Snail和Slug的基因表达,抑制E-cadherin的转录,同时上调Fibronectin和CollagenⅠ基因表达,促进肠上皮细胞EMT,在IBD小肠纤维化中发挥一定作用。
简介:摘要目的分离和培养小鼠鲍曼囊壁层上皮细胞,为进一步深入研究其生理作用提供基础。方法通过细胞筛联合磁性分离的方法分离小鼠肾小体,原代培养后获取壁层上皮细胞,诱导壁层上皮细胞分化为足细胞。使用免疫荧光染色、实时定量PCR和Western印迹法检测壁层上皮细胞和足细胞特异性标志物。结果原代培养的壁层上皮细胞呈现铺路石样,表达壁层上皮细胞特异性标志物Claudin-1和干细胞标志物CD133和CD24,不表达肾小管上皮细胞蛋白、系膜细胞和足细胞标志蛋白。体外培养传代至6代的壁层上皮细胞仍表达Claudin-1、CD133和CD24。经过诱导分化后,壁层上皮细胞可表达足细胞特异蛋白WT-1和Synaptopodin。结论细胞筛联合磁性分离法提取肾小体,体外培养获得的小鼠壁层上皮细胞可以在体外诱导表达足细胞标志蛋白。
简介:摘要回顾性分析2015年1月至2018年12月郑州大学第一附属医院病理确诊的9例肝血管周上皮细胞肿瘤(PEComa)患者,对其临床诊疗和预后进行分析。患者随访5.0~51.0个月,1例患者穿刺活检未进一步治疗,出院后6个月因肾脏肿瘤破裂死亡,另8例手术切除患者未发现肿瘤复发及转移。肝PEComa以女性多发,临床症状不典型,可伴腹痛、腹胀不适、食欲减退、发热、体重减轻。肝PEComa常单发,以肝右叶多见。术前完善影像学检查可协助诊断,CT平扫肿瘤呈均匀低密度或不均匀混杂密度,增强扫描动脉期表现为明显不均匀强化。肝PEComa以手术切除为主,良性首选手术治疗且预后良好,恶性需综合治疗。
简介:目的比较联合应用嗜热菌蛋白酶和I型胶原酶消化对耳蜗基底膜上皮细胞的分离效果。方法分离P0-3天SD大鼠基底膜,并将其分为四组,分别为:A组胰酶消化组;B组嗜热菌蛋白酶消化组;C组I型胶原酶消化组;D组嗜热菌蛋白酶和I型胶原酶消化组。收集各组消化的细胞进行悬浮培养和诱导分化,分别计数各组形成的细胞球数目,应用免疫荧光对获得的细胞来源进行鉴定,并比较各组Cytokeratin-18阳性细胞的百分率。结果从4种方法分离得到的细胞经培养后均可形成细胞球,表达干细胞标记物Nestin和细胞分裂标记物BrdU。获得细胞大部分均表达上皮来标记物E-cadherin和cytokeratin-18,而不表达间质细胞标志物Vimentin,经过诱导分化后可以分化成毛细胞样细胞。应用嗜热菌蛋白酶和I型胶原酶消化获得的细胞球数目显著高于其它组(P〈0.05);而采用胰酶消化获得的细胞cytokeratin-18阳性率显著低于其它组(P〈0.05)。结论联合应用嗜热菌蛋白酶和I型胶原酶消化耳蜗基底膜上皮细胞可以显著提高基底膜上皮细胞的分离效果,从而耳蜗前体细胞的研究提供有力研究基础。
简介:目的建立人脂肪干细胞(ADSCs)来源的诱导干细胞(iPSCs)分化为尿路上皮细胞的模型。方法经活检获取患者脂肪,制备原代ADSCs,采用仙台病毒法建立ADSCs来源的人诱导干细胞系(hiPS),对hiPS细胞进行向尿路上皮细胞的诱导分化,并使用免疫组化和流式细胞仪检测分化效果。结果脂肪干细胞高表达CD44,低表达CD45和CD105,使用仙台病毒法过表达脂肪干细胞OCT3/4,SOX2,KLF4和c-MYC的转录水平建立非整合的hiPS细胞系,证明其表达多能性标志,具有三胚层多向分化的能力。在相关因子和尿路上皮细胞专用培养基的处理下,诱导21d的hiPS细胞已出现上皮样结构,其表达尿路上皮细胞特异标志UP1a达到70%以上,免疫组化见分化后的细胞大量表达尿路上皮细胞特异标志UP1a,UP1b和UP2。结论ADSCs源性iPSCs具备向尿路上皮分化的能力,该细胞系的建立有望为尿道缺损患者开展个体化的尿道修补治疗提供优质的种子细胞。
简介:视网膜色素上皮细胞(retinalpigmentepithelium,RPE)的上皮间充质转化(epithelial-mesenchymaltransition,EMT)是增殖性玻璃体视网膜疾病(proliferativevitreoretinopathy,PVR)的主要发病机制,也是治疗脉络膜新生血管(choroidalneovascularization,CNV)时,造成抗血管内皮生长因子(anti-vascularendothelialgrowthfactor,anti-VEGF)疗效降低的重要因素。除此之外,随着细胞替代治疗作为年龄相关性黄斑变性(age-relatedmaculardegeneration,ARMD)的新型治疗方式而兴起,人类胚胎干细胞(hESC-RPE)、体细胞诱导多能干细胞(iPSC-RPE)定向诱导分化的RPE细胞以及来自于流产胎儿的胎儿视网膜色素上皮细胞(fetalRPE,fRPE)逐渐受到了研究者们的关注。为了发挥最好的治疗效果,保证治疗用细胞的稳定增殖及高效分化是极其重要的。但是在传代扩增的过程中,由于上皮间充质转化的存在,导致这些细胞出现增殖困难以及再分化能力下降,从而影响治疗效果并阻碍了治疗人群的普及,使细胞替代治疗难以推广。所以,鉴于上皮间充质转化在视网膜疾病的发生和治疗中都造成了重要影响,抑制视网膜色素上皮细胞发生上皮间充质转化就显得尤为重要,为此,我们将阻止上皮间充质转化研究的最新进展综述如下。
简介:摘要目的在体内外实验中探讨中药组合物夏丹芪(冬虫夏草、丹参、黄芪)对小鼠氡暴露肺组织损伤的防治效果。方法建立氡暴露小鼠模型,分为健康对照组、氡暴露组和夏丹芪干预氡暴露组,每组6只。HE和Masson染色观察120 WLM时各组小鼠肺组织病理变化,免疫组织化学法检测肺组织α-SMA蛋白和Vimentin蛋白表达;超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)试剂盒检测各组肺组织氧化应激水平。同时,利用生态氡室构建氡暴露细胞模型和氡暴露+夏丹芪干预细胞模型,粘附试剂盒检测不同组细胞粘附能力;Transwell迁移实验确定各组细胞迁移能力;Western blot法检测各组细胞E-cadherin和Vimentin蛋白的表达情况。结果与氡暴露组相比,2 mg/g夏丹芪干预可使氡暴露小鼠肺组织MDA浓度降低(t=4.43,P<0.05), SOD活性升高(t=3.22,P<0.05);肺组织α-SMA和Vimentin蛋白表达降低(t=3.08、7.57,P<0.05)。在体外实验中,与单纯氡暴露组相比,150和200 μg/ml夏丹芪干预后氡暴露细胞迁移能力下降(t=4.78、13.01,P<0.05),细胞粘附性能增强(t=3.41、12.55,P<0.05);E-cadherin蛋白表达增高(t=2.96、19.57,P<0.05),Vimentin蛋白表达明显下降(t=21.00、33.32,P<0.05)。结论中药组合物夏丹芪可通过降低辐射诱发的氧化应激、减弱氡暴露诱发的上皮细胞间质转化和纤维化,对氡暴露损伤具有一定的辐射防护作用,有望成为氡损伤的辐射防护剂。
简介:摘要目的探讨人鼻病毒1B (human rhinovirus 1B, HRV1B)感染对人肺支气管上皮细胞BEAS-2B代谢组改变的影响。方法HRV1B感染BEAS-2B细胞6 h和12 h后,采用非靶向代谢组学技术研究BEAS-2B细胞代谢组的改变情况。结果HRV1B感染BEAS-2B细胞6 h和12 h分别有93个差异显著代谢产物(differentially significant metabolites, DSMs)(上调47个DSMs、下调46个DSMs)和88个DSMs(上调37个DSMs、下调51个DSMs);HRV1B感染动力学(HRV1B 6 h∶12 h)过程中共鉴定到30个DSMs(上调12个DSMs、下调18个DSMs)。3组中未知DSMs占据比例均较大。脂肪酸、脂质、氨基酸、核苷酸和糖类的比例与HRV1B的感染时间呈现正相关,邻苯二甲酸二异壬酯等为HRV1B感染BEAS-2B细胞后的共同DSMs。结论HRV1B感染致BEAS-2B细胞的脂肪酸、脂质、氨基酸、核苷酸和糖类代谢物发生明显改变。
简介:摘要目的探究两色金鸡菊提取物马里苷对高糖诱导的视网膜上皮细胞(ARPE-19)上皮间质转化(epithelial mesenchymal transformation,EMT)的影响。方法利用高糖诱导ARPE-19细胞建立EMT模型,设control对照组,不通过浓度高糖干预组及马里苷高中低剂量组。CCK-8细胞活性实验观察高糖对细胞的影响。镜下观测细胞形态结构变化。Western blot实验观察间质标志物Fibronectin(纤维连接蛋白FN)以及上皮标志物E-cadherin(E-钙素)的表达情况。结果随着高糖浓度的依次递增,ARPE-19细胞的凋亡愈加明显,高糖干预24 h对照组[(97.97±1.56)%]与不同浓度高糖干预组[(88.31±3.34)%,(82.54±3.92)%,(77.35±6.14)%,(81.19±3.83)%,(53.17±5.71)%,(40.57±7.37)%,(31.27±8.92)%]相比差异有统计学意义(F=64.13,P<0.05);高糖干预48 h对照组[(100.00±2.06)%]与不同浓度高糖干预组[(85.09±7.87)%,(86.54±8.58)%,(74.48±3.21)%,(64.07±8.65)%,(58.64±8.45)%,(25.14±8.88)%,(7.665±7.91)%相比差异有统计学意义(F=48.83,P<0.05)。伴随着明显的结构形态的改变,ARPE-19细胞中E-钙素表达降低、FN表达升高。高糖干预48 h E-钙素的表达对照组(96.7±1.05)与不同浓度高糖干预组[(87.9±5.46),(62.71±2.01),(70.73±6.13),(67.97±8.05),(58.41±5.24)]相比差异有统计学意义,F=24.61,P<0.05);高糖干预48 h FN的表达对照组(100.00±0.01)与不同浓度高糖干预组(153.10±17.47),(137.7±25.24),(152.00±26.00)相比有显著差异,F=3.088,P<0.05)]。马里苷干预后,上皮标记物E-钙素恢复,间质标志物FN降低,马里苷干预48 h对照组E-钙素的表达量为(0.43±0.08),与马里苷高中低剂量组[(0.25±0.004),(0.36±0.01),(0.38±0.04),(0.31±0.01)]相比差异有统计学意义(F=7.865,P值均<0.05)),马里苷干预48 h FN的表达对照组为(102.20±2.10),与马里苷高中低剂量组[(188.30±13.01),(95.41±12.50),(136.10±9.49),(199.60±19.93)]相比差异有统计学意义(F=42.31,P<0.05)。结论高糖可以促进ARPE-19细胞发生上皮间质转化,造成其纤维化趋势,而马里苷可以改善其纤维化。