简介:摘要目的构建雌激素受体α配体结合域(ERα-LBD)表达载体,优化表达条件得到可溶性ERα-LBD蛋白。方法在Addgene网站检索关键词ESR(雌激素受体,estrogen receptor),选择符合条件的质粒载体pcDNA-HA-ER WT(Addgene plasmid # 49498; http://n2t.net/addgene:49498; RRID:Addgene_49498),设计引物并扩增得到目的片段ERα-LBD,分别构建蛋白表达载体pET-28a-LBD和pGEX-4T1-LBD,改变诱导温度、异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)浓度以及诱导时间对表达条件优化。待细菌裂解并提取蛋白后进行凝胶电泳,可在细菌上清的泳道中观察到明显的紫色蛋白表达条带,即为可溶性ERα-LBD蛋白。结果pET-28a-LBD重组质粒未能表达重组蛋白ERα-LBD,重组质粒pGEX-4T1-LBD在Rosetta和BL21(DE3)感受态中以1 mmol/L IPTG诱导仅能得到包涵体;以0.2 mmol/L IPTG 16 ℃过夜诱导培养,则可得到可溶性ERα-LBD蛋白。结论成功构建ERα-LBD表达载体并优化诱导表达条件,获得可溶性ERα-LBD蛋白。
简介:文章在共时平面重点考察了框式结构“非…不可”用于估测表达的语义条件。考察结论是:在言语表达中,“非…不可”有“非NP不可”和“非VP不可”两种性质类别,可以有言说者或当事者两种表达视角。“非NP不可”只有言说者表达视角,其用于估测表达的语义条件是:强调客观情态的[+推断性][+必须]语义特征。“非VP不可”有言说者和当事者两种表达视角,有纯粹主观认识和强势客观推断两种语义类别。纯粹主观认识的表达为非估测表达,强势客观推断的表达为估测表达。“非…不可”的估测表达属于推断性强势估测。具有[+推断性]语义特征是其用于估测表达的语义基础和前提。
简介:生物发光标记以其可视化,便捷,快速,灵敏,可用于活体研究等诸多优点越来越多地应用于科学研究中。本研究通过CaCl2方法将实验室构建的带有青海弧菌荧光素酶基因luxAB的重组质粒导入大肠杆菌Top10中,利用酶切和核酸电泳检测荧光素酶基因的存在,利用SDS-PAGE检测荧光素酶表达的情况,然后对其表达条件进行优化。单因素试验结果表明:在培养基初始pH值6.0,癸醛体积分数1.25‰,接种量1%,IPTG浓度0.1mmol/L,装液量50mL/150mL,温度37℃条件下,重组菌的发光度最大,即表达量最高。正交试验结果表明:当pH6,IPTG浓度0.08mmol/L,接种量1.2%,温度36℃时重组大肠杆菌表达情况最好,发光度达1262.7。本研究中的重组大肠杆菌为在益生菌等食品微生物中的应用提供技术依据。
简介:摘要目的获得人载脂蛋白A-I(apoA-I)重组蛋白原核表达的最佳条件。方法研究由诱导温度、IPTG终浓度、IPTG诱导时间等对apoA-I重组蛋白表达量的影响。结果SDS-PAGE验证各不同条件下获得目的蛋白条带为29kd;结果显示重组大肠杆菌菌株的最佳条件为32℃、IPTG诱导浓度为1.0mmol/L以及IPTG诱导时间为3h。结论成功在大肠杆菌中诱导表达出来apoA-I,并筛选出apoA-I原核表达的最优条件。
简介:根据黄瓜基因组数据库中CsaO20719基因编码区全序列设计引物,通过RT—PCR扩增的方法从黄瓜品种津研四号的叶片中克隆得到寡肽转运蛋白基因(oligopeptidetransportergene,OPT)。基因编码区全长为2013bp。该基因编码的蛋白由20种氨基酸组成,含有670个氨基酸残基,分子量和理论等电点分别为73kD和8.65。预测由该基因转录的寡肽转运蛋白为疏水蛋白,有14个连续的疏水片断。预测该蛋白不存在信号肽,为非分泌蛋白,存在OPT家族保守结构域,亚细胞定位在细胞膜上,主要功能为参与转运和底物结合。同源性和进化树的预测分析显示,OPT蛋白与毛果杨和蓖麻寡肽转运蛋白同源性分别达到了81%和79%,所转运的底物除有寡肽外,还包含有金属离子-烟草胺的螯合物等。qRT—PCR分析同一氮浓度处理OPT基因在不同部位表达结果显示,在无氮及低氮条件下,OPT基因在茎中表达量最高,其次为叶和茎尖。在高氮条件下,OPT主要在茎尖和叶中表达量较高,其次为茎,说明OPT基因在氮胁迫下存在于植物各个部位,并主要集中在生长旺盛的部位,为黄瓜的生长提供所需的能量。不同氮浓度下OPT在茎中表达分析结果显示,OPT基因在无氮及低氮下表达量增加,明显高于正常水平,并且随着氮浓度的降低,OPT的表达量增加,说明黄瓜OPT基因参与低氮胁迫应答反应,增强黄瓜耐低氮能力。