简介:摘要目的构建雌激素受体α配体结合域(ERα-LBD)表达载体,优化表达条件得到可溶性ERα-LBD蛋白。方法在Addgene网站检索关键词ESR(雌激素受体,estrogen receptor),选择符合条件的质粒载体pcDNA-HA-ER WT(Addgene plasmid # 49498; http://n2t.net/addgene:49498; RRID:Addgene_49498),设计引物并扩增得到目的片段ERα-LBD,分别构建蛋白表达载体pET-28a-LBD和pGEX-4T1-LBD,改变诱导温度、异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)浓度以及诱导时间对表达条件优化。待细菌裂解并提取蛋白后进行凝胶电泳,可在细菌上清的泳道中观察到明显的紫色蛋白表达条带,即为可溶性ERα-LBD蛋白。结果pET-28a-LBD重组质粒未能表达重组蛋白ERα-LBD,重组质粒pGEX-4T1-LBD在Rosetta和BL21(DE3)感受态中以1 mmol/L IPTG诱导仅能得到包涵体;以0.2 mmol/L IPTG 16 ℃过夜诱导培养,则可得到可溶性ERα-LBD蛋白。结论成功构建ERα-LBD表达载体并优化诱导表达条件,获得可溶性ERα-LBD蛋白。
简介:BAC-TO-BAC杆状病毒表达系统是一种快速、高效、便捷的表达系统.将人可溶性CD14(sCD14)基因克隆入pFASTBAC1转移质粒中,重组质粒转化DH10BAC感受态细胞,目的基因通过同源重组插入BacmidDNA中,后者转染sf21昆虫细胞获得重组杆状病毒.利用重组蛋白C-末端的6×His@Tag,经TALON金属螯合色谱将重组病毒感染昆虫细胞获得的无血清培养上清--步纯化得到重组蛋白,计算表明从1L培养基中可纯化到约8mg纯度大于95%的重组sCD14蛋白,免疫印迹结果表明重组蛋白具有与抗6×His单抗和抗CD14单抗结合的抗原性.疑胶迁移实验和细胞活性实验表明重组sCD14蛋白能在体外与LPS结合,并能增强LPS诱导THP-1细胞产生细胞毒性因子.
简介:本研究建立可溶性人类白细胞抗原-Ⅰ类(sHLA-Ⅰ)检测方法,并探讨贮存血中sHLA-Ⅰ浓度变化的意义.采用ELISA双抗夹心法定量检测60例正常广东人血清中sHLA-Ⅰ水平和20例献血员成分血中sHLA-Ⅰ含量.结果表明:采用本技术时,可溶性HLA-Ⅰ最低检测限为2.84ng/ml,批内变异系数为5.80%,批间变异系数为9.00%,回收率≥98.57%,广东人sHLA-Ⅰ平均值为(699.54±360.10)ng/ml.贮存28天的RBC和随机供者血小板的sHLA-Ⅰ的浓度明显高于其它成分血,并且与成分血中残存的白细胞数和贮存时间有关.结论:用ELISA法检测可溶性HLA-Ⅰ灵敏、特异、稳定,在临床输血过程中可考虑选择性输注含有不同浓度可溶性HLA-Ⅰ的成分血.
简介:摘要目的探讨过敏性紫癜(HSP)患儿血清中可溶性CD137的表达水平及其与病情严重程度相关性。方法选择HSP患儿46例作为研究组,健康儿童37例作为正常对照组,用ELISA法检测两组血清可溶性CD137水平。用统计学分析两组血清中可溶性CD137水平及其与病情严重程度的相关性。结果研究组血清可溶性CD137水平显著高于正常对照组(P<0.05)。即与健康儿童对照组相比,HSP患儿血清中可溶性CD137呈现异常高表达,且HSP患儿血清中可溶性CD137含量与病情严重程度呈正相关。结论HSP患儿血清中可溶性CD137水平显著升高及其与病情严重程度正相关,提示CD137可能参与了HSP的发生、发展。
简介:摘要目的构建肝脏及淋巴结窦内皮细胞C型凝集素糖基识别结构域(LSECtin-CRD)双半胱氨酸(Cys)突变体原核表达载体,获得LSECtin-CRD突变体蛋白,并鉴定其生物学活性。方法基于LSECtin-CRD的三维结构模型选择突变位点;通过重叠延伸PCR(SOE-PCR)对LSECtin-CRD基因引入Cys点突变,构建pET28b-Tat-LSECtin-CRD突变体载体;IPTG诱导可溶性表达LSECtin-CRD突变体蛋白,SDS-PAGE鉴定蛋白质表达水平;亲和层析方法对突变体蛋白进行纯化;通过检测突变体蛋白的甘露糖和GlcNAc结合能力鉴定其生物活性。结果菌液PCR和测序结果表明LSECtin-CRD双Cys突变体G205C-A227C和G205C-D279C原核表达载体构建成功,SDS-PAGE结果显示两个突变体蛋白均实现高效可溶性表达,单糖结合试验结果显示两个突变体蛋白均具有良好的生物学活性。结论本研究获得了具有生物学活性的LSECtin-CRD双Cys突变体蛋白,为进一步研究LSECtin-CRD结构和功能关系提供实验依据。
简介:摘要目的探讨细菌性感染性心内膜炎(infectious endocarditis,IE)术后辅助性T细胞17(T helper cell 17,Th17)相关因子、可溶性细胞间黏附分子1(soluble intercellular adhesion molecule-1,sICAM-1)、凝血功能的表达及其意义。方法选取2016年12月至2018年12月首都医科大学附属北京安贞医院心脏外科手术治疗且符合纳入标准的IE患者进行前瞻性分析,38例IE患者作为观察组;选取同期健康体检者30名为对照组。采用双抗夹心酶联免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法测定两组血清Th17相关因子[白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)、白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)、白细胞介素17(interleukin-17,IL-17)及白细胞介素21(interleukin-21,IL-21)]、sICAM-1及凝血功能指标[可溶性P-选择素(P selectin,sP-SLT)]浓度,并对两组间相关指标的浓度差异进行统计学分析比较。结果观察组患者术前血清IL-1β、IL-6、IL-17及IL-21浓度[(29.88±6.49)、(14.89±3.31)、(21.89±3.01)、(563.26±67.36) ng/L]显著高于对照组[(16.56±4.11)、(7.52±2.34)、(12.91±1.01)、(423.38±56.49) ng/L],差异有统计学意义(t值分别为10.30、10.74、17.20、49.48,P均<0.05)。观察组术前血清sICAM-1、sP-SLT浓度[(1 247.57(581.39,1794.66) μg/L、(60.29±6.61) mg/L]显著高于对照组[(837.28(405.68,954.47) μg/L、(27.37±5.56) mg/L],差异有统计学意义(Z=12.37、t=22.30,P均<0.05)。术后感染性心内膜炎患者血清IL-1β、IL-6、IL-17及IL-21浓度[(16.19±4.07)、(7.73±2.40)、(13.83±0.94)、(425.33±52.12) ng/L]较术前[(29.88±6.49)、(14.89±2.31)、(21.89±3.01)、(563.26±67.36) ng/L]均显著降低,差异有统计学意义(t值分别为11.02、13.25、15.76、9.98,P均<0.05)。术后感染性心内膜炎患者血清sICAM-1、sP-SLT1浓度[(901.46(472.15,1 276.58) μg/L、(30.70±5.31) mg/L]较术前[(1 057.26±463.06) μg/L、(60.29±6.61) mg/L]显著降低,差异有统计学意义(Z=11.16、t=21.51,P均<0.05)。结论在IE患者中Th17相关因子、sICAM-1及sP-SLT呈高浓度表达,同时术后上述因子浓度降低,提示以上因子可能作为辅助诊断、评估IE患者病情及预后的相关因子。
简介:摘要:实验室用水质量的好坏直接影响到分析结果,可溶性硅含量是一、二级水的重要指标,执行GB/T6682《分析实验室用水规格及试验方法》,该方法中可溶性硅含量的分析时间需
简介:摘要可溶性髓样细胞触发受体-1(solubletriggeringreceptorexpressedonmyeloidcell-1,sTREM-1)是髓样细胞触发受体-1(triggeringreceptorexpressedonmyeloidcells-1,TREM-1)的可溶形式。TREM-1是免疫球蛋白超家族受体中的成员,主要表达于中性粒细胞、噬细胞与成熟单核细胞的表面。
简介:目的探讨抽动秽语综合征(TS)患者疾病过程中免疫损伤的相关机制。方法应用抗脑抗体(ABAb)、抗核抗体(ANA)、可溶性白介素-6受体(sIL-6R)及可溶性gp130(sgp130)的ELISA方法商品试剂盒,检测患者和正常人血清中sIL-6R、sgpl30及相应抗体的含量。结果TS组血清sIL-6R、sgp130含量显著高于正常对照组(44.078±15.777):(30.290±9.048),P〈0.01;(69.032±24.604):(47.309±14.137),P〈0.01);TS患儿血清ABAb、ANA检出率显著高于对照组(66.7%:3.6%,P〈0.01;53.3%:25%,P〈0.05)。且ABAb水平与sgpl30负相关(r=-0.451,P=0.046)。结论在TS患者血清中sIL-6R、sgp130水平显著增高表明依赖IL-6信号传导的生理功能上调和反馈抑制的网络机制启动;自身免疫相关的损伤机制参与了疾病发生发展的病理生理过程。