载脂蛋白A-I的原核表达及其条件的优化

载脂蛋白A-I的原核表达及其条件的优化

闫莹1,2石新艳3王华3王云龙2王蕾1*

1.青岛大学药学院药理学系，中国山东、青岛，邮编266021

2.青岛大学附属医院生物标本库，中国山东、青岛，邮编266100

3.青岛大学附属医院中国山东、青岛，邮编266100

通讯作者：王蕾qdwanglei67@126.com

摘要：目的获得人载脂蛋白A-I(apoA-I)重组蛋白原核表达的最佳条件。方法研究由诱导温度、IPTG终浓度、IPTG诱导时间等对apoA-I重组蛋白表达量的影响。结果SDS-PAGE验证各不同条件下获得目的蛋白条带为29kd;结果显示重组大肠杆菌菌株的最佳条件为32℃、IPTG诱导浓度为1.0mmol/L以及IPTG诱导时间为3h。结论成功在大肠杆菌中诱导表达出来apoA-I，并筛选出apoA-I原核表达的最优条件。

关键词：载脂蛋白A-I、原核表达、条件优化

载脂蛋白A-I(ApolipoproteinA-I,apoA-I)是高密度脂蛋白（HDL）的主要成分，约占95％1，其在体内胆固醇逆向转运过程中发挥关键作用2。成熟apoA-I由243个氨基酸残基组成的单一多肽3，含有8个串联重复片段，为两性α螺旋4，此为apoA-I发挥在体内发挥作用的结构基础。

作者利用重组大肠杆菌实现了apoA-I在大肠杆菌中的原核表达，并对表达条件优化，获得重组蛋白的最大产量，为之后研究奠定基础.

1材料和方法

1.1重组质粒

ApoA-I的pET-30b(+)重组表达质粒由实验室保存。

1.2试剂和仪器

异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）、低分子蛋白标准、硫酸卡那霉素（Kan）购自北京索莱宝公司；胰蛋白胨、酵母粉购自Oxoid公司；TEMED购自Sigma公司；BCA试剂盒、5XSDS蛋白上样缓冲液购自碧云天公司。其他试剂均为国产分析纯。垂直电泳仪、高速冷冻离心凝胶成像分析系统。

1.3重组蛋白的原核表达

将大肠杆菌加入卡那霉素至30μg/ml，于在37℃，220rpm条件下振摇，直到培养至OD值为0.5~0.64，之后改变培养温度、IPTG诱导浓度及IPTG诱导时间进行最佳条件探究，数小时后，离心超声破碎菌体后离心。

1.4SDS-PAGE（12%）鉴定重组蛋白

配制分离胶10ml（12%）及配制浓缩胶4ml（4%）。加样前加热煮沸蛋白使之变性，每个孔加样20μl；电泳后染色脱色后使用成像系统拍照。

1.5重组蛋白原核表达的条件优化

1.5.1表达温度

将重组菌株按照1：100接种量分别接种到1个含100mLLB液体培养基(含Kan30μg/ml)三角瓶中,于37℃条件下培养至OD600为0.5-0.6时加入IPTG使其终浓度为1.0mmol/L,后将菌液均分为4份,分别于25、28、32和37℃诱导3h。

1.5.2IPTG诱导浓度

同上培养至OD600为0.5-0.6时将菌液均分为4份,加入IPTG使其终浓度分别为0.5、1.0、1.5和2.0m/L,于37℃诱导3h。

1.5.3IPTG诱导时间

同上培养至OD600为0.5-0.6时加入IPTG使其终浓度为1.0mmol/L,37℃继续培养，分别于1、2、3、4、5和6h取样。

1.6纯化蛋白含量测定

纯化蛋白由SDS-PAGE鉴定，BCA法定量浓度。

2.结果

2.1温度、IPTG诱导浓度及时间的影响最佳条件为32℃、1.0mmol/LIPTG、3h。

2.2经镍柱纯化后蛋白量比较由图2可知，优化组蛋白表达量相较于未优化组大大提高至3.18±0.374mg/ml。

3结论

本研究通过条件优化得到载脂蛋白A-I的最佳温度为37℃，最佳IPTG诱导浓度为1mm，最佳IPTG诱导时间为3h，该研究将对之后载脂蛋白A-I的研究奠定了物质基础。

参考文献

1周细龙etal.载脂蛋白与动脉粥样硬化.心血管病学进展,152-156(1991).

2Ren,F.&He,C.GeneCloneofApolipoproteinAⅠ,ProkaryoticExpressionandthePreparationofPolyclonalAntibody.JournalofMilitarySurgeoninSouthwestChina(2011).

3Li,W.H.,Tanimura,M.,.,Luo,C.C.,Datta,S.,.&Chan,L.,.Theapolipoproteinmultigenefamily:biosynthesis,structure,structure-functionrelationships,andevolution.JournalofLipidResearch29,245(1988).

4Borhani,D.W.,Rogers,D.P.,Engler,J.A.&Brouillette,C.G.CrystalstructureoftruncatedhumanapolipoproteinA-Isuggestsalipid-boundconformation.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica94,12291-12296(1997).