简介:目的利用昆虫细胞,杆状病毒系统表达猪瘟病毒(CSFV)E2蛋白,用于E2蛋白功能、开发CSF新型疫苗以及建立相关血清学诊断方法等研究。方法采用RT—PCR扩增CSFVE2基因,将PCR产物克隆到pGEM—T—Easy载体,将该基因插入到pFast—BacHTA载体中,构建重组转座载体后转化DH10Bac感受态细胞,获得重组Bacmid质粒后转染sf9昆虫细胞,传毒3代,对表达蛋白进行Western-blot及免疫组化鉴定。结果成功克隆CSFVE2基因,其核苷酸序列为1119bp。SDS-PAGE电泳结果显示表达E2蛋白相对分子质量约为43×10^3,Western-blot和免疫组化结果证实表达蛋白能够被CSFV标准阳性血清识别。结论在Bac-to-Bac杆状病毒系统中的成功表达了CSFVE2蛋白,与CSFV标准阳性血清具有较好的反应性。
简介:利用已克隆植物的R基因NBS序列中保守基序设计简并引物进行PCR扩增是克隆NBS有效的方法。从广东普通野生稻HLW028中克隆出3条序列,经同源性分析均为NBS,序列号为DQ272573~DQ272575。从NCBI中下载普通野生水稻和功能已知的水稻NBS—LRR类基因,与本试验所提交的NBS进行聚类分析。这些NBS可分为5大类,其中DQ272574是一个新的NBS基因类型。从野生水稻中克隆NBS基因存在P—loop、RNBS。A、kin-2、RNBS.B、RNBS—C和PLAL的基序。RT—PCR结果表明,培矮64中的Pikh的表达量比2种野生稻中高。从培矮64中扩增出1个完整读码框的cDNA。
简介:鉴定主栽水稻品种及育种骨干亲本的抗瘟基因型,有助于了解不同抗病基因在品种中的分布,为抗病品种选育及品种布局提供参考。本研究选取辽宁省24份水稻材料,根据7个抗稻瘟病基因的保守区设计引物,扩增各品种的编码区序列,对扩增的序列进行对比分析,鉴定各基因在24个品种中的分布情况。结果表明:辽宁省24个主栽水稻品种均不携带Pi21、Pi36、Pi37或其抗病等位基因,而Pid2、Pid3、Pita和Pik/Piks/Pikm/Pikp在24个品种中以不同突变类型及不同频率出现,其中,在2个品种中检测到Pid2抗病基因及Pid3的抗病等位基因;4个品种检测到Pita的抗病等位基因,Pita的等位基因中新发现的几处碱基突变并未影响抗病基因的功能;所有品种中均无与Pik及其复等位基因完全一致的序列,但利用携带AVR-pik的稻瘟病菌接种鉴定结果表明,辽粳454和沈农265携带的Pik等位基因可能仍具有抗病基因功能。
简介:利用DNA重组和细胞体内同源重组技术,分别获得了P7.5启动子和P11启动子单独带动的乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)基因的重组痘苗病毒和同一个重组痘苗病毒中含有P7.5和P11启动子分别带动一个HBsAg基因(正反两个插入方向)的四种重组痘苗病毒,比较了它们对HBsAg表达的影响。含P7.5启动子的比含P11启动子的重组痘苗病毒表达的HBsAg水平更高些;在同一个重组痘苗病毒中P7.5和P11两个启动子分别带动HBsAg基因时,两个启动子同向转录表达的HBsAg水平较低,而两个启动子又向转录时表达的HBsAg水平较高,但均没有单一P7.5启动子带动的HBsAg基因的表达水平高。
简介:SARS-CoV感染动物模型的建立可加深对SARS病原学的了解和发病机制的研究,加速实验室诊断技术的建立、抗病毒药物的筛选和疫苗的开发,同时也有助于给该病一个更精确的定义。可以说SARS动物模型的建立,不但是SARS研究的瓶颈问题,其应用更是贯穿SARS研究的整个过程。到目前为止,已经报道有4种非人灵长类动物(恒河猴、食蟹猴、绒猴、非洲绿猴)和6种啮齿类动物(大鼠、小鼠、豚鼠、田鼠、仓鼠、转基因鼠),以及雪貂、家猫等可以作为SARS动物模型用于实验研究,并已经开始利用动物模型进行疫苗和药物的安全性和有效性评价。本文就已报道的各类SARS动物模型进行综述,并根据动物模型和SARS患者的比对,提出动物模型建立的技术要点。
简介:目的为建立SHIV艾滋病动物模型提供毒力较强的病毒株,将新合成的SHIV-XJ02170病毒适应猴体,并增强其毒力.方法实验前采集猴血清并进行血清学检查和PCR检测.选出13只无SIV,STLV-1,SRV/D和B病毒感染的猴.第一批实验,将SHIV前病毒DNA质粒经肌肉注射到猴体内,每只500μg;SHIV病毒液,经静脉注射到猴体内,每只2ml.病毒质粒和病毒液各接种2只猴.当第一批猴体检出病毒后,10ml感染猴的全血,抗凝后静脉注射到第二批猴体内,当第二批猴检出病毒后再将10ml感染猴的全血静脉注射到第三批猴体内,连续传代4次.每批实验均定期采集血液标本,分别用肝素和EDTA抗凝,进行病毒分离;病毒基因PCR检测;CD4,CD8测定;病毒抗体检测.结果SHIV-XJ02170病毒和SHIV-XJ02170前病毒DNA质粒在猴体内的传代中均能分离出病毒;从传代猴的血浆和外周血单核细胞(PBMC)中检出了病毒DNA和RNA基因;CD4,CD8测定结果显示有暂时性倒置现象,后变为正常倒置与正常交替出现;在传代的猴血清中检测出特异性HIV病毒抗体.结论SHIV-XJ02170病毒与SHIV-XJ02170前病毒DNA质粒,均能在恒河猴体内复制.
简介:目的:设计靶向乙型肝炎病毒(HBV)基因保守区的人工microRNA(amiRNA),考察其对HBV基因表达的抑制作用。方法:比对HBV全基因组现有序列,选择保守区设计amiRNA,定向克隆到pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR载体,将amiRNA载体与HBV复制载体pHBV1.31共转染HepG2细胞,72h后收取细胞上清,ELISA检测HBV表面抗原(HBsAg)及e抗原(HBeAg)的含量,荧光定量PCR检测HBVDNA含量。结果:amiRNA可显著抑制细胞上清HBsAg、HBeAg和HBVDNA的水平。结论:amiRNA作为防治HBV感染的潜在有效手段之一值得进一步深入研究。