简介:目的:构建人血清白蛋白(hSA)与小鼠乳清酸蛋白(mWAP)调控序列的杂合基因座。方法与结果:在pBR322载体上连入预先无痕连接的3对同源臂,利用基于Red同源重组系统的缺口修复(gap-repair)技术,分别对8kb的mWAP基因座3′调控区、16kb的hSA基因组编码序列及13kb的mWAP基因座5′调控区进行连续3次基因抓捕,最终将全长37kb的乳蛋白杂合基因座构入pBR322载体;通过PCR扩增、限制性内切酶消化和序列测定验证,确定mWAP基因座中的编码序列被精确地置换为hSA的基因组编码序列。结论:构建了整合有mWAP-hSA杂合基因座的pBR322载体,为研究杂合基因座在乳腺中的表达效果及置换型基因座表达的可行性提供了数据。
简介:目的:分析HHEX基因序列及蛋白质的结构特点,研究其在发育过程中的作用。方法:采用生物信息学方法分析预测HHEX基因序列、蛋白质结构,以及与其他蛋白质的相互作用。结果:小鼠HHEX基因cDNA全长1771bp,CDS区全长816bp,其编码的HHEX蛋白含271个氨基酸残基,相对分子质量为30×103,为不稳定蛋白,具有α螺旋、无规卷曲、延伸链与β转角;功能分析表明HHEX蛋白是参与调控关键发育过程的转录调控因子,并与EOMES、FOXA2、KDR、WNT7A、HEXB、TG、SLC30A8、IGF2BP2及CDKAL1蛋白有相互作用。结论:HHEX基因及蛋白生物信息学分析为HHEX基因及蛋白的相关研究提供了重要的信息基础。
简介:目的:检测抗凝血酶Ⅲ(ATⅢ)转基因山羊外源基因的拷贝数及ATⅢ蛋白的表达量,分析拷贝数与蛋白表达量的相关性。方法:用Primer5.0软件设计外源基因ATⅢ及山羊管家基因GAPDH的引物,以倍比稀释的标准品进行实时荧光定量PCR,制作标准曲线,通过标准曲线计算外源基因拷贝数;通过酶显色底物法检测ATⅢ蛋白的含量。结果:依据ATⅢ和GAPDH基因标准曲线方程计算得到的山羊个体间外源基因的拷贝数相差很大,最少的为5,最多为25,且不同转基因山羊间ATⅢ表达水平的差别达10倍以上。结论:外源基因表达水平在受到拷贝数的影响外,也受到整合位点等其他因素的重要影响。
简介:目的:构建汉滩病毒包膜糖蛋白基因的真核表达载体,并加入可增强免疫应答效应的细胞因子CD40L基因,检测其可否在真核细胞中表达。方法与结果:参照GenBank中汉滩病毒M基因和小鼠CD40L的全基因序列设计引物,通过聚合酶链反应(PCR)获得M和CD40L基因片段,将其与pCI—neo载体相连,测序证实该载体构建成功后,将此真核表达载体以脂质体转染法转染至哺乳动物细胞CHO—K1中,利用间接免疫荧光法(IFA)检测发现M基因和CD40L基因可以同时表达于CHO-K1细胞中。结论:构建了带有CD40L基因的汉滩病毒包膜糖蛋白重组质粒并获得表达,为深入研究汉滩病毒感染后包膜糖蛋白引起的特异性免疫应答规律奠定了实验基础。
简介:采用PCR方法,根据文献报道的人成骨蛋白-1(OP-1)成熟肽基因序列,设计并合一对引物,从含人成骨蛋白基因的质粒中扩增获得大小的420bp的DNA片段,连接到pGEM-T载体进行测序,证明获得人成骨蛋白成熟肽基因片段,继之以pPIC3.5k为表达载体构建重组表达质粒,并经PCR及酶切鉴定。
简介:目的:构建一个牛dSl酪蛋白调控序列指导人溶菌酶(hLYZ)基因组序列的杂合基因座。方法:采用本实验室发明的连续3步缺口修复技术。将6个无痕连接的同源臂插入以pBR322为载体的骨架中,构成能进行3次连续基因抓捕的载体,利用Red同源重组系统介导的缺口修复技术,分别抓捕牛aSl酪蛋白3’端调控序列(9kb)、hLYZ基因座序列(5kb)、牛axSl酪蛋白5’端调控序列(20kb),使这3个基因片段自动无痕地连接在基因抓捕载体上,形成牛oLSl酪蛋白一hLYZ杂合基因座。结果:实验经过PCR扩增、限制性内切酶酶切验证和序列测定,验证了hLYZ的基因组序列对牛仪S1酪蛋白编码基因组序列的精确置换。结论:这种修复技术为乳腺生物反应器高效表达大载体的制备提供了可行的思路及方法。
简介:目的:人肌球蛋白7A(MYO7A)基因是遗传性耳聋分子筛查的候选基因之一。从已知的MYO7A非同义单核苷酸多态性(nsSNPs)位点数据库中筛选可能与致病表型相关的nsSNPs位点,以提高MYO7A基因耳聋分子诊断的有效性和准确率。方法:首先,从NCBI数据中心的dbSNP数据库(dbSNP)和DeafnessVariationDatabase数据库获得MYO7A基因的SNPs数据和基因的相关信息;然后,通过SIFT、PolyPhen-2、PANTHER、PhD-SNP、MutationTaster、SNP&GO和MutPred软件进行nsSNPs表型致病性分析,预测潜在致病位点;接着,应用ClustalX2和GeneDoc软件进行同源氨基酸序列比对,分析潜在致病的nsSNPs位点保守性;最后,应用SwissModel平台选择性地对某些突变蛋白质的三维结构进行建模,并分析结构域的变化。结果:预测出MYO7A的104个高风险致病的nsSNPs位点,包括25个已报道的耳聋相关nsSNPs位点;高风险致病的nsSNPs位点中,有42个位于肌球蛋白马达(myosinmotor)结构域,其中12个预测有致病风险的nsSNPs位点与MYO7A基因致聋的突变研究报道一致。肌球蛋白马达结构域中包含30个新预测的潜在致病性nsSNPs位点,其中仅L366P位点在7个预测软件中具有高度一致性。通过对L366P位点位点突变前后的三维模型构建,发现存在蛋白结构的改变,且同源性比对结果显示了该位点的高度保守性。结论:MYO7A的L366P为潜在高风险致病性nsSNP位点,推测该基因突变可能与耳聋表型相关。本研究所采用的分析筛选方法对MYO7A基因突变的临床筛查及其他致病基因的nsSNPs筛选具有重要的参考价值。