简介:为了提高抗病性分子标记检测的效率,为番茄病害检测及多抗品种选育提供技术依据,本研究通过改良CTAB法、96孔深孔板快速提取番茄微量叶片DNA;利用抗根结线虫病Mi标记,在L16(45)正交设计试验基础上,采用直观量化分析和方差分析两种方法,对番茄实用化PCR分子标记PCR反应的5个因素(引物,Mg2+,dNTPs,模板DNA和Taq酶)进行优化;随后分别筛选黄化曲叶病毒病、烟草花叶病毒病、根结线虫病、枯萎病、叶霉病和颈腐根腐病6种病害的8个实用化PCR分子标记PCR程序的退火温度;并对循环次数进行筛选;最后利用优化后的PCR体系与程序对供试的1442份番茄材料(包括番茄种质资源,群体材料,组合及品种)进行抗病性鉴定。结果表明番茄实用化PCR分子标记的PCR最佳反应体系(20μL)为引物0.5μmol/L、Mg2+1.5mmol/L、dNTPs0.3mmol/L、DNA480ngDNA、聚合酶1.0UTaq;PCR程序中8个分子标记共同最适退火温度为56℃,最佳循环次数为33次;筛选出585份多抗(含2种以上的抗病基因)番茄材料,可作为中间材料或亲本材料进行多抗品种选育。该实用化PCR分子标记的PCR体系的建立为番茄利用抗病基因分子标记检测与筛选多抗种质资源、品种或群体材料提供了标准化的程序。
简介:Ahighlysensitiveelectrochemiluminescence-polymerasechainreaction(ECL-PCR)methodforK-raspointmutationdetectionisdeveloped.Briefly,K-rasoncogenewasamplifiedbyaRu(bpy)32+(TBR)-labeledforwardandabiotin-labeledreverseprimer,andfollowedbydigestionwithMvaIrestrictionenzyme,whichonlycutthewild-typeampliconcontainingitscuttingsite.Thedigestedproductwasthenadsorbedtothestreptavidin-coatedmicrobeadthroughthebiotinlabelanddetectedbyECLassay.TheexperimentresultsshowedthatthedifferentgenotypescanbeclearlydiscriminatedbyECL-PCRmethod.Itisusefulinpointmutationdetection,duetoitssensitivity,safety,andsimplicity.
简介:随着现代分子生物学技术的发展,反转录聚合酶链式反应技术在甘薯病毒检测上的应用越来越广泛。采用该技术可检测出甘薯组织中含量极低的病毒RNA,具有灵敏度高、特异性强等优点。在本研究中根据NCBIGenBank中收录的SPCSV病毒外壳蛋白(CP)基因核苷酸序列的保守区域设计了3对特异性引物,使用天根生化科技(北京)有限公司生产的QuantOneStepRT-PCRkit试剂盒,针对影响扩增产物的影响因素退火温度进行优化,建立了甘薯退绿矮化病毒的RT-PCR检测方法。该方法使RT-PCR在一管内完成,大大降低了外源物质的污染及RNA降解的几率,可作为甘薯SPCSV病毒的快速检测方法。
简介:近年手足口病(hand-foot-mouthdisease)在儿童中流行情况较为严重,由肠道病毒感染引起,可经消化道、呼吸道传播,易造成流行[1]。主要表现为口腔黏膜溃疡性疱疹及四肢末端水疱样皮疹,主要病原为柯萨奇病毒A组16型(CoxA16)和肠道病毒71型(EV71)[2]。1资料与方法1.1研究对象2009年南京儿童医院确诊为手足口病,持续发热并出现嗜睡、易惊、烦躁不安、抽搐等神经、呼吸系统症状,住院隔离治疗的患儿161例。男95例,女66例。年龄最小7个月,最大11岁。手足口病诊断标准参照卫生部办公厅《手足口病诊疗指南(2008年版)》[3]。1.2研究方法1.2.1标本采集征得患
简介:Abstract:TheP24antigentest,HIVRNAPCRtest,HIVisolation/cultureandfourth-generationHIVuniformAg/AbassayarebeingutilizedindiagnosingacuteHIVinfectionindifferentlabs.ManyfactorslimittheuseofscreeningforacuteHIVinhigh-riskpopulations,inblooddonorsandduringvoluntaryHIVtesting,including,cost,technique,sensitivityandspecificity.InthisreviewweexploreanewNAATmethodwhichinvolvesHIVRNART-PCRonpooledsamples.Thistechniqueisabletoscreenforacuteinfectionsinalargetestingvolumeandmayheusedasascreeningmethodinhigh-riskpopulationsandblooddonors.
简介:摘要:PCR温度控制系统的软件设计是PCR仪设计中非常重要的部分之一,其控温效果的好坏直接影响PCR仪基因扩增的成功与否。因而本文主要针对芯片级PCR中温度控制系统软件进行研究。关键词:聚合酶链式反应温度控制SOPC模糊自整定PID一、软件系统工作原理PCR仪中,最重要的部分是对反应温度的控制。PCR仪系统根据用户预先设定的参数来控制变温系统的反应温度。系统首先采集变温系统的当前温度,将当前温度和用户设定的变性温度进行对比,通过控制控制器的运算得到一个输出,将此输出加到被控对象上,使其温度上升至变性温度,达到变性温度后,根据输入的变性温度持续时间,控制变温系统温度持续时间。当此时间到达之后,进入下个反应的温度控制即退火温度的控制。执行完退火阶段温度控制后进入延伸阶段的温度控制。当执行完三个反应的温度控制后,一个循环周期结束,进入下一个循环周期。系统不断的重复控制三个温区的温度,当达到用户给定的循环次数后,反应结束……
简介:犬细小病毒病感染是由犬细小病毒(cPv)引起犬只死亡的最重要传染病之一,目前诊断该病的方法主要是胶体金快速检测试板法,虽然检测方法较简便快速,但其敏感性较差。通过对NCBI网站GenBank发表的CPV-2基因组序列的分析,选择该病毒VP2基因保守序列设计引物,通过对阳性病料扩增及扩增产物测序,与NCBI发表的相关基因对比,同源性在99.8%-100%,成功建立了特异性、灵敏度高的PCR方法,最低只需2.5PgDNA模板。在对28例可疑CPV病例检测中,本方法检出25例阳性、3例阴性,阳性率为89.28%;胶体金检测板检测出20例阳性、8例阴性,阳性率为71.42%,证实PCR方法比胶体金检测更敏感。
简介:摘要:手足口病是儿科的多发病和常见病,具有较高的传染性和流行性,通常发生在夏秋季节,以5岁以下的婴幼儿最为常见。其中,以手、足部出疹,口腔黏膜疱疹或溃疡等为特征性表现。一般情况下患儿在发病的5~7天自行缓解,也有少部分患儿会发展至重症,即出现脑膜炎、脑炎、脊髓炎、脑脊髓炎等中枢神经系统受累并发症,甚至伴有肺水肿、肺出血及循环衰竭等症状。危重症患儿与轻症患儿不同,因其病情进展较快,若不及时接受有效治疗,可危及生命安全。目前临床上诊断手足口病的金标准为病毒分离培养,虽然准确率高,但检测时间长,在现实应用过程中存在比较明显的缺陷,因此寻求一种操作简单、方便、费用低、准确率高、灵敏度高的检查方法十分必要。以PCR为基础的分子检测,具有准确率高、灵敏度高,适合临床的需求。
简介:为建立暴马丁香ISSR-PCR最佳反应体系,本研究以暴马丁香基因组DNA为模板,首先通过单因子试验设计筛选出各影响因子比较适宜的浓度范围,再利用正交试验,对暴马丁香ISSR-PCR反应有影响的模板DNA、dNTPs、Mg2+、TaqDNA聚合酶和引物浓度等5种因素4个水平进行了优化试验。暴马丁香的ISSR-PCR最佳反应体系最终确定为:在25μL的反应体系中,DNA模板是40ng,Mg2+浓度为2.0mmol/L,引物浓度为0.4μmol/L,TaqDNA聚合酶用量为1.5U,dNTPs浓度为0.2mmol/L。利用该体系从60条ISSR引物中筛选出了扩增条带清晰、多态性好的10条引物。这一体系的建立及多态性引物的筛选为以后利用ISSR分子标记技术进行暴马丁香的有关研究提供了科学依据。
简介:摘要:目的:研究在乙型肝炎病毒临床检验中应用PCR技术的效果。方法:此次研究开展起止时间在2021年11月到2022年11月,随机抽选该时段我院诊治的66例乙型肝炎患者作为观察对象,以计算机抽签法作为分组方法,将其分成研讨组(33例)和参考组(33例)。在对乙肝病毒进行检测时,研讨组接受PCR技术检测,参考组接受酶联免疫吸附法检测,比较两组检测准确性、乙肝5项检测阳性率及不同浓度乙肝表面抗原检测重复率。结果:研讨组检出率、HBeAb阳性率、HBeAg阳性率、HBsAg阳性率均较参考组明显更高,且研讨组对低、中浓度HBsAg检验的批内和批间重复率均高于参考组,组间对比P<0.05,有统计分析意义。结论:PCR技术在乙型肝炎临床试验中的应用产生了显着的诊断效果,值得推广到乙型肝炎临床试验。