简介:目的探讨腺相关病毒(AAV)载体转导碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)基因对肌腱愈合的影响,并观察腺病毒、AAV以及脂质体-质粒三种基因治疗载体应用于肌腱所产生的组织反应。方法取13只成年白色来亨鸡的双侧中趾趾深屈肌腱(26根),随机分为实验组和对照组,每组13根,实验组肌腱完全切断后注射AAV2-bFGF并以改良Kessler法修复,对照组不注射AAV2-bFGF,仪以改良Kessler法修复。第4周末行免疫组织化学染色,第8周末测定趾屈曲功。将6只成年新西兰白兔的趾深屈肌腱(36根)分成三组,每组12根,分别注射10μL的腺病毒、AAV2和脂质体-质粒载体,术后第3、7、14天分别取肌腱,进行石蜡切片、HE染色。结果AAV2-bFGF可以在术后4周显著地提高肌腱bFGF的表达,而且不增加趾屈曲阻力(粘连形成)。所测屈曲功第8周末实验组为(0.052±0.031)J,对照组为(0.049±0.035)J,两组间差异无统计学意义(t=0.1266,P=0.8984)。脂质体-质粒载体组肌腱组织反应重于腺病毒载体组,AAV2载体组肌腱组织反应最轻,在腱外膜处有组织反应,而腱内膜区域几乎无组织反应。结论用AAV2载体转bFGF基因至肌腱能有效增加愈合肌腱的bFGF。在三种所研究的载体中,腺病毒和AAV2载体引起的组织反应比脂质体-质粒载体轻。AAV2引起的组织反应最轻。AAV2可能会成为肌腱的转基因良好载体。
简介:目的:利用Adeasy-1系统,构建并鉴定CARP基因重组腺病毒载体.方法:PCR扩增含有CARP全长cDNA的片段,经测序验证无误后,亚克隆至pAdTrack-CMV穿梭质粒,再与pAdEasy-1质粒在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组产生腺病毒载体质粒.经过抗性筛选以及酶切鉴定得到阳性的重组质粒,再在293细胞中进行包装扩增,利用Adeasy系统上的绿色荧光蛋白标签鉴定病毒表达.结果:测序证实PCR产物为CARP全长cDNA;抗性筛选及酶切鉴定均表明重组腺病毒载体构建成功;转染293细胞3天后可见绿色荧光,回收病毒可以重复感染293细胞,证明病毒包装成功.
简介:目的构建表达Nogo受体(NgR)特异性siRNA199的重组质粒。方法按照E1bashir等设计原则和siRNA表达载体的要求,在合成、筛选出基因沉默效率较高的siRNA199基础上,设计带有BamHⅠ、HindⅢ酶切黏性末端、终止识别序列和LOOP环的shRNA,并将其克隆入载体pRNAT-1/6.1/Neo,构建成NgR特异siRNA199重组质粒,然后进行酶切鉴定及基因测序。结果设计的shRNA成功克隆入载体pRNAT-1/6.1/Neo,构建成NgR特异siRNA199重组质粒,酶切鉴定及基因测序表明设计序列完全相符,目的基因序列准确无误。结论重组质粒构建成功,为构建病毒载体及观察重组质粒抑制大鼠NgR基因的表达对脊髓损伤的修复作用奠定了基础。
简介:摘要目的构建人巨细胞病毒(human cytomegalovirus, HCMV)转录的长链非编码RNA4.9(long non-coding RNA4.9, lncRNA4.9)干扰慢病毒载体。方法设计并合成3条以lncRNA4.9为靶点的干扰序列,构建穿梭质粒GV248和目的干扰序列的重组质粒,测序验证序列,将重组质粒与骨架质粒pHelper1.0、pHelper2.0共转染293T细胞,收集病毒颗粒并检测拷贝数。将干扰慢病毒载体转染THP-1细胞,观察荧光表达量,通过real-time RT-PCR法检测干扰效率。结果构建的3组慢病毒干扰载体(LV1、LV2、LV3),LV2和LV3具有干扰效率,LV2组干扰效率最高。结论成功构建lncRNA4.9干扰慢病毒载体,为后续进一步研究lncRNA4.9的功能奠定了基础。
简介:目的构荧光蛋白和canstatin融合蛋白基因的真核表达载体pEGFP-N1/canstatin,以深化研究血管生成抑制剂canstatin的生物学性能和用于肿瘤生物治疗的可能性。方法提取人胚肝总RNA,RT—PCR扩增canstatin基因片断,T—A克隆到pGEM—T中,从pGEM—T/canstatin克隆载体中,将人canstatincDNA亚克隆入真核表达载体pEGFP-N1,构建含人canstatincDNA的重组质粒pEGFP-N1/canstatin,通过酶切鉴定出重组体并测序分析。结果成功构建pEGFP—N1/canstatin真核表达载体,双酶切及测序鉴定显示canstatin基因片断正确插入载体,与Genebank中报道的序列一致。结论pEGFP—N1/canstatin真核载体的构建为进一步进行canstatin蛋白表达和活性研究以及canstatin用于基因治疗奠定了基础。
简介:摘要目的从辐照160Gd2O3靶料中提取中子反应产物161Tb,以实现国产化制备161Tb。方法利用中国绵阳研究堆(CMRR)对160Gd2O3靶料进行中子辐照,经过破靶、溶样、镧系(LN)树脂柱分离纯化、二甘醇酰胺(DGA)柱溶液置换等流程,得到无载体161Tb产品。采用γ能谱纯度、金属杂质含量、比活度、放化纯、放射性浓度等关键指标对161Tb产品进行质量检测与控制。结果单次制备可得到33.4 GBq 161TbCl3,放射性浓度为16.8 GBq/ml,核纯度≥99.9%,放化纯为99.2%,金属杂质含量满足拟定标准,比活度为6.02×1017 Bq/mol。与1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸-D-苯丙氨酸1-酪氨酸3-苏氨酸8-奥曲肽(DOTATATE)标记后0、72 h的放化纯分别为100%、95.8%。结论利用LN树脂进行无载体161Tb的制备,具有分离性能高、单次载量高等优势,为国内161Tb标记药物的研发提供良好的核素保障。