简介:摘要近年来转录组学快速发展,成为探索生殖细胞和人类早期胚胎发育机制的重要手段,其中单细胞测序技术的出现更具有里程碑意义。在生殖细胞水平,卵母细胞中RNA的稳定对于受精后胚胎的发育具有重要意义;同时多项研究表明精子中存在着复杂的RNA分子调控系统,可能与精子异常密切相关。精卵结合后,受精卵的激活和分化发育涉及多个基因适时的激活和转录表达,为后期着床进行铺垫。最新的技术能够同时对同一细胞进行多层面检测,也深入揭示了甲基化与转录、遗传之间的关系。而随着“无创”概念深入人心,囊胚培养液的检测愈发受到重视,其中多个转录因子被证实与胚胎发育相关,有可能成为优质胚胎新的评价体系。
简介:摘要目的分析抑郁症患者较健康人各脑区转录组基因的差异表达情况。方法在基因表达谱数据库(gene expression omnibus,GEO)中搜索抑郁症病例-对照设计并含有原始数据的研究,设定物种为人。以各数据集所有转录组基因为观察变量,利用在线软件Network Analyst进行主成分分析(principal component analysis,PCA),整体评估抑郁症患者各个脑区(包括前额叶、前扣带回、杏仁核、海马)相对正常人各脑区的转录组改变差异的程度。利用limma算法分别筛选倍数变化为1.2倍、1.5倍、2.0倍的差异基因(differentially expressed gene,DEG),P<0.05为差异有统计学意义。对来源于不同数据集不同脑区的差异基因进行维恩分析,以获取该脑区稳定的差异表达基因。利用DAVID在线软件对稳定差异表达的基因进行功能富集分析,探讨抑郁症患者不同脑区的GO功能及KEGG通路的改变情况。结果抑郁症患者各个脑区(前额叶、前扣带回、杏仁核)相对健康对照各个脑区的转录组整体水平改变程度较轻,基于转录组基因表达水平进行的主成分分析无法有效区分健康-疾病状态;几乎不存在倍数变化大于2.0倍的差异表达基因;维恩分析结果提示不同脑区的多个数据集差异基因无交集;倍数变化大于1.2倍相对稳定的差异表达基因功能与抑郁症无直接关联。结论抑郁症疾病状态下,患者脑组织转录组水平改变微乎其微,因多方面限制识别抑郁症易感特定基因仍具有挑战性。
简介:摘要单细胞转录组测序(scRNA-seq)是一种在细胞水平观测单个细胞之间转录组差异的新兴技术,其基本策略是捕获单细胞,经裂解得到微量mRNA,逆转录后扩增,cDNA用于制备测序文库。目前该技术已被广泛应用于多个学科领域。视觉神经系统在结构上包括视网膜、外侧膝状体及视皮层等,负责视觉信息的获取和处理,进而形成视觉。视觉信息占全部感觉信息的70%以上,故对视觉神经系统的研究显得尤为重要。随着科学技术的快速发展,单细胞转录组测序技术的研究成果也越来越多,该技术正逐渐成为指导临床实践的重要工具,为基础研究向临床转化搭建了桥梁。本文介绍单细胞转录组测序技术的主要技术路线和方法,并详述其在视觉系统研究中的应用。
简介:摘要目的分析晚期肺腺癌患者肿瘤细胞异质性,探索肿瘤细胞亚群转录组特性以寻找个体特异的治疗方案。方法从人类肿瘤相关的基因表达汇编(GEO)数据库下载肺腺癌单细胞转录组测序数据芯片编号GSE123902,包含收集于2018年至2019年于纪念斯隆-凯特琳癌症中心手术切除的8例原发肺癌组织,3例脑转移样本,1例骨转移样本,1例肾上腺转移样本。过滤、鉴定并分离肿瘤细胞,对表达数据进行标准化、降维处理并根据表达模式对细胞进行聚类,利用基因差异表达分析,基因集变异分析(GSVA)探索不同肿瘤细胞亚群的表达特性。结果共分离Ⅳ期肺腺癌原发灶肿瘤细胞211个,脑转移灶肿瘤细胞965个,骨转移灶肿瘤细胞659个,肾上腺转移灶肿瘤细胞14个。样本间比较涉及肿瘤血管生成、上皮间充质转化、侵袭转移相关的基因和基因集,例如骨转移组明显上调的波形蛋白(VIM,logFC=3.185,校正后的P<0.01),差异有统计学意义;膜微囊蛋白-1(CAV-1,logFC=2.757,校正后的P<0.01),差异有统计学意义。单样本分析中,脑转移和骨转移灶中均鉴定出耐药相关细胞亚群,存在多个耐药相关基因上调,包括脑转移细胞亚群中上调的载脂蛋白2(LCN2, logFC=1.822,校正后的P<0.01),差异有统计学意义、骨转移细胞亚群中上调的趋化因子1(CXCL1,logFC=1.604,校正后的P<0.01),差异有统计学意义。结论通过单细胞转录组分析肿瘤细胞异质性,可为晚期肺腺癌患者寻找个体化治疗方案提供线索。
简介:摘要目的基于肿瘤基因组图谱(TCGA)计划数据库构建脑胶质瘤Cox比例风险回归模型,并在中国脑胶质瘤基因组图谱计划(CGGA)数据库中验证,探讨该模型对预后的评估价值。方法回顾性分析TCGA数据库中668例脑胶质瘤患者(试验组)、CGGA数据库中619例脑胶质瘤患者(验证组)的临床资料及其胶质瘤组织RNA测序数据,同时选取5例来源于TCGA数据库的正常脑组织样本的RNA测序数据作为对照。筛选TCGA数据库中脑胶质瘤与正常组织间的差异基因。在试验组中应用Cox回归方法建立风险模型。分别在试验组和验证组中,采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线、Log-rank法检验高、低风险患者的生存差异,采用单因素、多因素Cox回归分析法分析影响脑胶质瘤患者预后的因素;将独立预后因素纳入分析,绘制列线图。高风险组中高表达的基因用于基因本体(GO)功能富集分析。结果试验组与验证组的年龄(<40岁或≥40岁)、性别、生存期差异均无统计学意义(均P>0.05),但世界卫生组织(WHO)肿瘤分级、病理类型分布、异柠檬酸脱氢酶1/2(IDH1/2)突变率等差异均有统计学意义(均P<0.05)。筛选出SHD、MRC2、RPLP0P6、HOXA5、SULF2、FOXJ1、CDKN2A、NKX2-5、PLEKHA4及CDK4共10个差异基因,用于构建Cox比例风险回归模型;模型风险值>0.646为高风险,≤0.646为低风险。试验组中高风险患者的1、3、5年生存率分别为66.6%、27.7%和17.8%,而低风险患者的1、3、5年生存率分别为98.4%、88.2%和73.6%;验证组中高风险患者的1、3、5年生存率分别为69.0%、40.1%和30.6%,而低风险患者的1、3、5年生存率分别为91.0%、76.7%和63.3%。试验组和验证组高、低风险患者生存期差异均有统计学意义(均P<0.05);单因素和多因素Cox回归分析结果显示,年龄≥40岁(HR=3.031,95%CI:2.152~4.269,P<0.001)、WHO肿瘤分级Ⅳ级(HR=1.961,95%CI:1.494~2.575,P<0.001)及Cox比例风险回归模型高风险(HR=3.100,95%CI:1.915~5.020,P<0.001)是影响预后的独立危险因素,用于构建个体化评估患者1、3、5年生存概率的列线图,其预测结果与患者预后匹配度高,一致性指数为0.844。GO功能富集分析结果显示,高风险组中高表达的基因与肿瘤的微环境、免疫调节等13项功能关系密切。结论基于转录组测序数据构建的Cox比例风险回归模型和列线图或可用于脑胶质瘤患者的预后评估。
简介:摘要目的通过RNA测序(RNA sequencing,RNA-Seq)对先天性马蹄内翻足(congenital talipes equinovarus,CTEV)患儿血浆中游离的总RNA行全转录组测序,比较CTEV患儿与正常儿童血浆的mRNA、长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)、环状RNA(circular RNA,circRNA)以及微小RNA(microRNA,miRNA)的差异表达,揭示CTEV的可能致病机制。方法选取3例CTEV患儿(试验组)及3例正常儿童(对照组)血浆样品,应用RNA-Seq技术分析3对血浆样品的转录组,筛选出CTEV患儿与正常儿童的差异表达基因与转录本。应用基因本体论方法对差异表达基因进行功能显著性富集分析,基于基因与基因组京都百科全书对差异基因进行显著性信号通路富集分析。结果成功构建样品的基因表达谱:试验组和对照组共有181个差异表达基因,其中58个上调基因,123个下调基因。差异表达lncRNA 23个,上调12个,下调11个。差异表达miRNA 23个,上调11个,下调12个。未筛选出差异表达circRNA。其中分泌磷酸蛋白1(secreted phosphoprotein 1,SPP1)和核糖体蛋白S27(ribosomal protein S27,RPS27)在试验组和对照组中基因表达量差异明显,差异倍数分别是82.24和0.01。结论RNA测序可对CTEV患儿和正常儿童的血浆中差异表达基因进行筛选。SPP1和RPS27可能与CTEV的发病相关。
简介:摘要目的分析影响脑死亡供者供肝移植术后受者早期移植物功能不良(early allograft dysfunction, EAD)的分子标志物及临床因素,建立将分子标志物和临床因素相结合的预测移植术后EAD的预警体系。方法回顾性分析2017年7月至2018年8月在郑州大学第一附属医院肝脏移植中心接受同种异体原位肝移植的87例成年受者的临床资料以及对应的供者临床信息。通过单因素分析,找出EAD的潜在危险因素,并进行Logistic回归分析以找出独立危险因素;并从中选取肝移植术后8例发生EAD和8例未发生EAD的组织标本,进行转录组测序,寻找与EAD相关信号通路。结果通过临床数据分析发现供者总胆红素、淋巴细胞以及受者术前总胆红素是脑死亡供者供肝移植术后受者EAD的独立危险因素。通过转录组测序发现EAD不良组与非EAD组之间有3 857个显著差异的mRNA,其中1 751个在发生EAD的供肝组织中表达上调,2 106个下调。通过基因本体论和京都基因与基因组百科全书分析发现炎症与代谢相关的信号通路与移植术后EAD有关。结论早期移植物功能不良相关的炎症与代谢信号通路结合供者总胆红素、淋巴细胞以及受者术前总胆红素对预测肝移植受者早期移植物功能不良的发生具有潜在的诊断意义。
简介:摘要目的分析人富血小板血浆(PRP)调控人表皮干细胞(ESC)的靶基因。方法(1)收集陆军军医大学第一附属医院行泌尿外科手术的6例男性患者术后弃用的包皮组织,患者年龄为5~25岁,既往身体健康,无泌尿系统感染,采用快速贴壁法培养人ESC并进行形态学观察及鉴定。收集解放军南部战区总医院1名29岁女性健康志愿者静脉血40 mL,采用二次离心法提取PRP。(2)将培养成功的原代人ESC按照随机数字表法分为对照组和PRP处理组,每组3孔。对照组细胞不行特殊处理;PRP处理组待细胞贴壁12 h,在培养基中加入PRP,使其最终体积分数为2.5%。提取RNA应用RNA测序技术进行2组人ESC转录组测序和数据分析,以错误发现率<0.05、差异倍数≥4为标准应用Dr. Tom数据挖掘系统筛选差异表达基因,对获得的差异表达基因进行基因本体论(GO)富集分析找出显著富集的GO条目。再用京都基因和基因组(KEGG)信号通路注释分析进一步寻找差异表达基因可能参与的生物学过程或者代谢通路。最后,选取与再上皮化过程相关且差异表达明显的基因,利用实时荧光定量反转录PCR验证基因的差异表达情况。对数据行独立样本t检验。结果(1)培养细胞呈克隆样生长,形态为铺路石样,CD49f阳性率达95.132%、CD71阳性率为0.006%,证明ESC原代培养成功。(2)质控数据分析显示,选取样本质量较好,序列比对百分比较高,满足测序要求。(3)测序数据显示,2组间共有449个差异表达基因,其中上调基因354个、下调基因95个,进一步聚类分析确定2组间有18个显著上调基因和5个显著下调基因。GO富集分析以及KEGG信号通路注释分析表明,显著差异表达基因主要富集在表皮构建和角化过程,同时可能与白细胞介素17信号通路相关。(4)选取了与再上皮化过程相关且差异表达明显的角蛋白19、角蛋白10以及S100A7基因进行验证。实时荧光定量反转录PCR显示,与对照组比较,PRP处理组细胞角蛋白19 mRNA和S100A7 mRNA表达量明显升高(t=10.270、5.690,P<0.01),角蛋白10 mRNA表达量明显降低(t=7.306,P<0.01),与测序数据结果一致。结论PRP调节人ESC功能促进创面再上皮化涉及角蛋白19、角蛋白10以及S100A7等多个基因的转录调控,深入探讨PRP影响人ESC的可能调控网络将为其后续临床治疗提供依据。
简介:摘要目的分析和验证结缔组织生长因子(CTGF)刺激对视网膜Müller细胞基因表达谱的影响。方法将体外培养的视网膜Müller细胞分为对照组、CTGF组。对照组细胞采用正常DMEM完全培养基培养;CTGF组细胞采用含有10 ng/ml CTGF的DMEM完全培养基持续培养24 h。收集处于对数生长期的细胞行细胞划痕实验,对比分析两组细胞的细胞迁移率;应用HiSeq测序技术对两组细胞进行全转录组测序,获得生物学大数据,在此基础上分析差异表达的miRNA;通过基因注释(GO)功能显著性富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路显著性富集分析对差异miRNA的功能及信号通路进行分析。基于转录组数据筛选出两组间差异表达倍数位于前10名的基因,分析其基因特征。采用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)、Western blot和免疫荧光定性检测对骨形态发生蛋白4 (BMP4)的mRNA和蛋白表达进行验证。结果CTGF组细胞迁移率较对照组明显升高,差异有统计学意义(t=3.453,P=0.026 )。对照组与CTGF组之间共有325个差异表达基因,其中上调者152个,下调者173个。GO功能显著性富集分析结果显示,差异miRNA的功能主要分为生物学过程、细胞成分和分子功能3类。KEGG通路显著性富集分析结果显示,差异miRNA表达高度富集在神经系统间信号传递、细胞间黏附以及细胞因子与其受体相互作用等相关的通路。分析两组间差异表达倍数位于前10名的基因,这些差异表达基因参与组织炎症反应及纤维化过程等不同的代谢通路及生物学过程。qRT-PCR、Western blot及免疫荧光定性检测结果显示,CTGF组细胞中BMP4 mRNA及蛋白表达均较对照组明显提高,差异有统计学意义(t=39.490、10.110、5.470,P=0.004、0.001、0.006 )。结论CTGF通过上调Müller细胞中BMP4的表达而促进细胞的增生和迁移导致组织纤维化并可诱导炎症反应。
简介:摘要目的通过转录组测序(RNA-seq)分析小檗碱对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌USA300基因组表达谱的影响,研究小檗碱对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的抑菌机制。方法基础研究。本研究使用标准菌株USA300,该菌株为中科院上海药物所蓝乐夫课题组2019年所赠送。用1/2最低抑菌浓度(MIC)(64 mg/L)和1/8MIC(16 mg/L)浓度的小檗碱处理和无小檗碱处理耐甲氧西林金黄色葡萄球菌USA300,分析USA300差异基因表达情况。将差异基因筛选条件设为:P值<0.05,且差异倍数>2。采用SPSS 20.0进行统计分析。结果通过测序结果发现,高浓度组与正常对照组相比,共有754个差异基因表达,其中上调基因主要为lukD、lukE、ssaA等,下调基因主要为lukF-PV、lukS-PV、clfA、splB~splF、sspA等;低浓度组与正常对照组相比,仅有19个差异基因表达,其中上调基因为speG、scpB、rpsQ等,下调基因为betA、bccT等。结论本研究USA300转录组基因表达情况,了解经小檗碱作用后差异基因表达情况,推测小檗碱主要通过调控细菌细胞壁水解功能、白细胞毒素及其他毒力因子的表达发挥对MRSA的抑菌作用。
简介:摘要目的基于转录组学数据筛选影响脑胶质瘤恶性进展及替莫唑胺耐药的关键基因,分析其在脑胶质瘤中的表达及意义。方法本研究通过分析GSE23806数据库(63株细胞株)、癌症体细胞突变目录(COSMIC)数据库(34株细胞株)及中国脑胶质瘤基因组图谱(CGGA)计划数据库(325例患者)中的转录组学数据,分别筛选出在胶质瘤干细胞中高表达的差异基因、在替莫唑胺耐药细胞中高表达的差异基因以及与胶质母细胞瘤恶性预后相关的基因,进而筛选出共同差异基因。通过CGGA与癌症基因组图谱(TCGA)计划数据库(636例患者)验证该基因在不同世界卫生组织(WHO)级别、不同四分型亚型的脑胶质瘤中的表达差异;采用Kaplan-Meier生存曲线比较该基因表达量不同的胶质母细胞瘤患者总生存期的差异;通过单因素和多因素Cox回归分析研究该基因对脑胶质瘤患者总生存期的影响;通过基因本体(GO)功能富集分析及京都基因和基因组百科全书(KEGG)通路富集分析预测其潜在的生物学功能。结果通过分析共同差异基因,筛选出岩藻糖基转移酶Ⅶ(FUT7)作为目标基因。FUT7在胶质瘤干细胞中呈现高表达(P=0.025),且在替莫唑胺耐药的细胞中高表达(P=0.033)。在CGGA数据库(325例)和TCGA数据库(636例)中,FUT7在WHO Ⅱ、Ⅲ及Ⅳ级组间表达量的差异有统计学意义(均P<0.001),其中Ⅳ级中表达量最高,Ⅱ级中表达量最低;两数据库中,FUT7在四分型组间表达量的差异均有统计学意义(均P<0.001),均在间质型中表达量最高。CGGA数据库和TCGA数据库中具有生存数据的胶质母细胞瘤患者(分别为138例和168例)中,FUT7高表达者比低表达者生存期短(P=0.002和P=0.013);单因素分析结果显示,FUT7的表达量、放疗及化疗均为胶质母细胞瘤患者总生存期的影响因素(均P<0.05);多因素Cox回归分析结果显示,FUT7表达量、放疗及化疗均为影响胶质母细胞瘤患者总生存期的独立危险因素(均P<0.001)。GO功能富集分析显示,FUT7表达量正相关的基因富集在免疫反应、炎性反应、凋亡、趋药性、白细胞迁移及细胞增殖等功能上。KEGG通路富集分析显示,FUT7正相关的基因富集在JAK-STAT信号通路、TNF信号通路及NF-κB信号通路上。结论FUT7可能是影响脑胶质瘤恶性进展及替莫唑胺耐药的基因,其机制可能与免疫反应、炎性反应、凋亡、趋药性、白细胞迁移及细胞增殖功能,JAK-STAT3和NF-κB等信号通路有关。
简介:摘要:施工组织设计按编制时间和服务对象的不同可分为投标阶段的施工组织设计(简称投标施组)和项目实施阶段的施工组织设计(简称实施性施组)。在编制投标性施工组织设计时,编标人员往往存在投标施组与以往类似项目实施性施组相互套用,使投标施组针对性不强,不符合招标文件要求的现象。本文从两者的相同点和不同点出发,揭示两者的内在关联,对于提升技术标书质量具有现实意义。
简介:摘要调节性T细胞(Treg)是机体维持免疫耐受不可或缺的T细胞亚群。Treg数量和功能的异常可以导致机体发生自身免疫反应,从而对自身稳态产生破坏。活化T细胞核因子(NFAT)、B淋巴细胞诱导成熟蛋白(BLIMP)-1、干扰素调节因子(IRF)4等转录因子在T细胞的生长、发育中,发挥重要调控作用。NFAT、BLIMP-1、IRF4对Treg的发育和功能亦具有重要作用。笔者拟就NFAT、BLIMP-1、IRF4对Treg的调控及其可能的作用机制的最新研究进展进行阐述。
简介:摘要目的探究甲基转移酶样蛋白3(methyltransferase like 3,METTL3)和去甲基化酶肥胖相关蛋白(fat mass and obesity-associated protein,FTO)在H7N9病毒感染中发挥的作用及可能的分子机制。方法利用Western blot(WB)检测H7N9病毒感染A549细胞后METTL3和FTO的表达。敲低和过表达METTL3和FTO,H7N9病毒感染后用WB和TCID50检测其对病毒复制的影响。利用转录组测序方法对METTL3或FTO敲低及野生型对照细胞进行了转录组水平基因差异表达分析,对发挥作用的潜在靶标进行初步分析。结果H7N9病毒感染A549细胞24 h后METTL3的表达上调,FTO无明显变化。敲低METTL3和FTO后,病毒核蛋白(nucleoprotein, NP)表达水平和病毒滴度显著下降,过表达METTL3和FTO后,病毒滴度显著增加。转录组测序结果显示在METTL3或FTO敲低组与对照组之间分别发现314和555个差异表达基因,GO功能富集分析和KEGG通路富集分析结果表明这些基因与宿主免疫应答相关。结论METTL3和FTO可能通过调节宿主-病毒相互作用在H7N9病毒感染中起关键作用。