简介:目的利用逆病毒表达载体快速构建梯度过表达人MTA1稳转单克隆细胞系。方法利用噬菌斑原位杂交筛选人肺噬菌体文库,以阳性克隆为模板,RT-PCR获得人MTA1完整CDS序列。以逆病毒表达载体pMX为基础,经过多次酶切连接,构建逆病毒表达载体pMX—MTA1-flag—IRES—EGFP。将构建好的逆病毒载体系统,转染293-gag/pol细胞,包装出含该表达载体的逆病毒颗粒。以含病毒上清多次感染HCT116细胞,获得稳定转染MTA1的HCT116多克隆细胞系。将该多克隆细胞系按合适比例稀释后接种至10cm大皿,获得大量单克隆细胞系,以GFP为筛选标志,筛选不同荧光强度的单细胞克隆进行扩增并分析MTA1与GFP表达水平的线性关系。结果测序结果显示成功克隆出人MTA1表达序列。免疫荧光、WesternBlot结果证实成功构建出梯度过表达MTA1的稳转细胞系。相关性验证结果显示构建的非融合载体MTA1与GFP的表达呈明显的线性相关,相关系数r=0.932,P〈0.01。结论利用逆病毒表达系统,快速成功构建并筛选出MTA1与GFP非融合梯度过表达稳转单克隆细胞系,为MTA1基因功能研究提供了良好模型。该逆转录病毒平台可用于快速建立其他基因的稳转单克隆细胞系。
简介:双磷酸盐是恶性肿瘤骨转移治疗中被广泛应用的药物。体外实验表明双磷酸盐对乳腺癌、肺癌、肾癌、黑色素瘤、结肠癌、胰腺癌有直接或间接抗肿瘤作用。临床研究显示双磷酸盐联合内分泌治疗或细胞毒性药物治疗可对乳腺癌起协同抗肿瘤作用,但对绝经期女性使用双磷酸盐预防乳腺癌尚存在争议。去势抵抗前列腺癌患者使用双磷酸盐可减少骨相关事件(skeletal-relatedevents,SRE)发生风险,但在激素敏感性前列腺癌预防中未能显示出优势。双磷酸盐能够减少肺癌患者SRE发生概率,但其对患者总生存期无明显改善。对肾癌、膀胱癌骨转移患者使用双磷酸盐治疗可减少SRE发生风险,双磷酸盐可延长膀胱癌延长患者生存期。肾癌患者在双磷酸盐联合靶向药物治疗中获益与否尚待进一步研究证实。