大枣药材中黄曲霉毒素含量测定的方法验证

大枣药材中黄曲霉毒素含量测定的方法验证

尹力 ,唐丽 ,李永玺

云南白药集团股份有限公司，云南 昆明650500

摘要：目的：确保对大枣药材黄曲霉毒素检测数据准确无误，用试验数据对生产起到指导作用，保障产品的经营活动。内容：通过对黄曲霉毒素B族和G族含量的测定方法进行系统适用性试验、精密度试验、检测限、定量限、线性关系与线性范围考察、重复性试验、准确度试验（加样回收试验）的验证，确保检验方法对被检物质有足够的专属性和灵敏度，通过重复性试验和回收率试验验证检验过程的回收率和重现性，并确定黄曲霉毒素B族和G族的检出限、定量限、线性范围，以确定该方法在本实验室的适用性及可控性。结论：通过对大枣药材中黄曲霉毒素含量的测定方法进行系统适用性试验、精密度试验、检测限、定量限、线性关系与线性范围考察、重复性试验、准确度试验（加样回收试验），各项试验测试结果均能满足要求，仪器性能稳定，质控结果满意。

关键词：大枣药材，黄曲霉毒素，方法验证

一、概述

大枣为鼠李科植物枣Ziziphus jujuba Mill.的干燥成熟果实，功效补中益气，养血安神。用于脾虚食少，乏力便溏，妇人脏躁。大枣中含有三帖酸、皂苷、生物碱、黄酮及糖苷类等成分，易霉变产生有毒物质，危害人体健康。由于药典中规定的测定方法前处理操作复杂，影响因素多，为确保检测数据准确无误，用试验数据对生产起到指导作用，保障产品的经营活动。综合以上原因，需要建立一套适用于本实验室的有效可控检测方法。

二、验证内容

1 仪器与试药

1．仪器与材料

1.1 样品：大枣药材

1.2 方法选择：按照《中国药典》2020版四部2351真菌毒素测定法 —，黄曲霉毒素测定法第一法中的光化学衍生法。

1.3 仪器及试药:

1.3.1高效液相色谱仪：

美国安捷伦1260高效液相色谱仪系统（配有荧光检测器、四元梯度泵、在线脱气装置、自动进样器、柱温箱）。

1.3.2色谱柱：Agilent  XDB-C18(5μm，4.6×250mm)

1.3.3试剂

甲醇，色谱级，德国默克

乙腈，色谱级，德国默克

超纯水，自制，使用前经0.45μm滤膜滤过后使用

氯化钠，分析纯，国药集团化学试剂有限公司

黄曲霉毒素免疫亲和柱 北京华安麦科生物科技有限公司

黄曲霉毒素混合对照品 来源中国食品药品检定所. 

1.3.4天平：电子天平（0.1mg /0.01mg/0.001mg）

2、验证内容

2.1试验方法

依据《中国药典》2020版四部2351真菌毒素测定法项下的具体内容如下：

2.1.1 系统适用性试验:照高效液相色谱法测定。

色谱条件与系统适应性  以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-乙腈-水（40:18:42）为流动相；采用光化学衍生法：光化学衍生器（254nm）；以荧光检测器检测，激发波长λex=360nm（或365nm），发射波长λem=450nm。两个相邻色谱峰的分离度应大于1.5。

对照品溶液的制备 精密量取黄曲霉毒素混合对照品溶液（黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1和黄曲霉毒素G2标示浓度分别为1.0μg/ml、0.3μg/ml、1.0μg/ml、0.3μg/ml）0.5ml，置10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，作为贮备溶液。精密量取贮备溶液1ml，置25ml量瓶中，用70%甲醇稀释至刻度，即得

供试品溶液的制备  取供试品粉末约15g（过二号筛），精密称定，置于均质瓶中，加入氯化钠3g，精密加入70%甲醇溶液75ml，高速搅拌2分钟（搅拌速度大于11 000r/min），离心5分钟（离心速度4000r/min），精密量取上清液15ml，置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，离心10分钟（离心速度4000r/min），精密量取上清液20ml，通过免疫亲合柱，流速每分钟3ml，用水20ml洗脱（必要时可以先用淋洗缓冲液10ml洗脱，再用水10ml洗脱），弃去洗脱液，使空气进入柱子，将水挤出柱子，再用1.5ml甲醇洗脱，收集洗脱液，置2ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.22μm）滤过，取续滤液，即得。

测定法  分别精密吸取上述混合对照品溶液5μl、10μl、15μl、20μl、25μl，注入液相色谱仪，测定峰面积，以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，绘制标准曲线。另精密吸取上述供试品溶液20～50μl，注入液相色谱仪，测定峰面积，从标准曲线上读出供试品中相当于黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1和黄曲霉毒素G2的量，计算，即得。

2.2精密度试验

精密吸取工作对照溶液20μl，按测定方法重复进样6次，测定峰面积值。对各次测得的峰面积值求相对标准偏差，相对标准偏差均不得过2.0%，精密度满足要求。

2.3 线性

精密量取黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1和黄曲霉毒素G2各适量，按上述对照品溶液制备方法配制称适当浓度的标准储备液，将各储备液分别稀释成对应的对照品溶液系列；分别取上述7个浓度的对照品溶液5～10μl注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定峰面积；以进样量的对数为横坐标，以峰面积为纵坐标作线性回归，绘制标准曲线。黄曲霉毒素G2在0.14ng/ml～140ng/ml浓度范围内线性关系良好，回归方程为y=165.24x+167.25，R²=0.9992；黄曲霉毒素G1在0.51ng/ml～102.015ng/ml浓度范围内线性关系良好，回归方程为y=93.185x-35.666，R²= 0.9999；黄曲霉毒素B2在0.5ng/ml～200ng/ml浓度范围内线性关系良好，回归方程为y= 119.76x +61.9,R²= 0.9997；黄曲霉毒素B1在0.54ng/ml～86.4ng/ml浓度范围内线性关系良好，回归方程为y=74.471x+32.629,R²=0.9997。线性均满足要求。

2.4检测限

取一定浓度的对照品溶液，精密量取10μl注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件进行测定，满足信噪比3:1为最低检测限的要求。

2.5定量限

取一定浓度的对照品溶液，精密量取10μl注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件进行测定，满足信噪比10:1为定量限的要求。

2.6重复性试验

取1批大枣药材，取供试品6份，依法测定。同时，取对照品溶液同法测定，分别计算出黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1和黄曲霉毒素G2的总量，6次进样均未检出黄曲霉，说明本方法在本实验室内重复性符合要求。

2.7加样回收率试验

采取全程加样法。取9份已知含量的大枣药材，精密称定，精密加入黄曲霉毒素混合对照品溶液适量，按含量测定方法测定，同时取对照品溶液依法测定，并计算出含量。计算回收率以标准中所提供的方法加标进行回收率试验，其三个浓度平均回收率在62.55%~77.91%范围内，RSD在0.48-4.64%范围内，满足要求《中国药典》2351中规定的60%-120%。

三、评价及建议

1. 大枣药材按本方法检测黄曲霉毒素，数据结果符合《中国药典》和《药品GMP指南》等相关标准。用该方法检测大枣药材中黄曲霉毒素的含量，结果准确可靠，可以在本实验室运用。

2. 黄曲霉毒素检测中，不同基质的前处理方法有差异，需根据基质性质选择合适的处理方法和处理的仪器设备。

参考文献

[1]. 《中国药典》2020版四部2351真菌毒素测定法，《中国药典》四部2020版药品质量标准分析方法验证指导。

[2].《药品生产质量管理规范》（2010年修订）。

[3].《药品GMP指南》（2010年修订）。

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