液体除菌过滤技术研究

液体除菌过滤技术研究

冯春皓

杰科（天津）生物医药有限公司  300467

摘要：随着制药科技的不断发展，除菌过滤技术也广泛应用于该领域，尤其在液体制剂生产过程中除菌过滤是无菌保障的关键因素，故本文将结合相关的法律法规对除菌过滤（液体）的原理、滤器选型、验证、完整性检测及其在无菌液体生产过程中的运用进行分析研究。

关键词：除菌过滤；微生物；兼容性；溶出物；完整性；无菌

1.除菌过滤定义及原理

除菌过滤是指在不影响产品质量的前提下，过滤去除流体中微生物的工艺过程[1]。

其原理是由于细菌不可透过致密的微孔滤材，故运用此原理将流体中的微生物去除分离，其过滤孔径均不大于0.22μm。FDA规定液体除菌级过滤器必须有截留试验证明[2]，即：每平方厘米的有效过滤面积可以截留107CFU的缺陷短波单胞菌。

2.液体除菌过滤器的选型

除菌过滤器的选型应根据工艺流体的性质进行选择，如液体稳定的温度范围、pH、组分特性、总体积及过滤效率是选择除菌过滤器所要考虑的必要因素。此外还应遵循新版药品GMP 附录1，第四十一条之规定：“过滤器应当尽可能不脱落纤维。严禁使用含石棉的过滤器。过滤器不得因与产品发生反应、释放物质或吸附作用而对产品质量造成不利影响。”[3]

目前常见的材质有聚偏二氟乙烯（PVDF）、聚醚砜（PES）、尼龙66（N66）、聚四氟乙烯（PTFE)。表1介绍了各种滤器材质性质：

表1各种滤器材质性质

3液体除菌过滤器验证

3.1细菌截留试验

其验证目的是过滤含有定量微生物的药液或代替溶液，用来模拟除菌过滤工艺的最差条件，从而确保该除菌过滤器的截留能力。

缺陷短波单胞菌（B.diminuta直径大约为：0.3-0.4μm，长度：0.6-1.0μm，ATCC 收录号19146）[4]：是细菌截留挑战用标准微生物，如果是特殊情况下，该细菌不能满足试验的最差条件，也可使用其他细菌代替，但要有相关的验证报告或技术数据证明替代细菌为最小微生物。

因试验用细菌可能受药液浓度、渗透压、pH等影响会使其失去生物活性，所以试验开始前还应保证细菌在药液中的活性，否则将使用代替溶液进行试验，而代替溶液也需经过风险评估和试验数据证明与目标药液的物理、化学性质基本一致，方可使用。

试验可选择三个或三个以上同规格、型号但不同批号的除菌过滤器，并采用0.45μm孔径的滤器作为每组试验的阳性对照，以上所用滤器均应通过完整性检测，且至少有一个试验用除菌过滤器的起泡点值在生产厂家规定值的100%-110%以内，从而确定该组试验为模拟的最差条件，待整体验证成功后，应规定实际生产中除菌过滤器完整性的合格起泡点值不小于模拟最差条件所用除菌过滤器的起泡点值。

试验开始应在待验证除菌过滤器上游药液中加入含有不低于挑战水平要求（即：107 CFU/cm2）的缺陷短波单胞菌，通过动力源使药液全部通除菌过滤器，并于下游的截留过滤器捕获可能通过的缺陷短波单胞菌，经过培养，确认是否有微生物增长，从而判断待验证的除菌过滤器是否被细菌穿透。而作为平行对照试验的0.45μm孔径过滤器可用回收计数法验证缺陷短波单胞菌全部通过。

3.2溶出物/析出物试验

溶出物[5-7]是指在合适溶剂中，于超过最差工艺条件的夸大的时间和温度条件下，从任一产品接触材料包括弹性体、塑料、玻璃、不锈钢或涂层组分中迁移的化合物，溶出物代表了迁移至产品中物质的最大可能。析出物[5-7]是指在实际的工艺条件下，从任一产品接触材料迁移至药物制剂中的化学物质。

选定的除菌过滤器与药液接触产生的析出物可能会影响药品的质量，但由于析出物的量通常较少，而目前分离和测试的方法不能将其定量分析，故采用风险评估的方法来确认在极限条件下将获得的溶出物数据是否对药液质量产生影响。

通常生产厂家会提供除菌过滤器在特定有机物或水中溶出物的相关参数，但由于药液过滤工艺的唯一性，企业还应进行工艺特异性的验证[8]，用以说明特定药液在特定除菌过滤工艺下可获得符合预定质量标准的药液。

首先企业应提供足量的且经过检验放行的药液，然后基于风险评估，确定哪些条件会有增加溶出物或析出物的风险。如1药液的属性：较多的有机物、药液pH的上下限、较高的浓度等；2表面积较大的除菌过滤器；3过高的过滤温度；4较长的过滤时间；5较大的过滤压力；6过滤前的处理：高压蒸汽灭菌（121℃，30min）等。然后在评估后的极限条件下模拟过滤工艺，确保溶出物或析出物最大限度的溶于药液。再使用经过方法学验证的紫外可见光谱法 (UV-Vis)、气相色谱-质谱（GC-MS）、反相高效液相色谱法（RP-HPLC）、总有机碳法（TOC）、傅立叶变换红外光谱法（FTIR）、非挥发性残留物（NVR）进行分析研究，最后将数据结合产品属性进行安全性评估，说明在极限条件下的除菌过滤工艺所产生的溶出物或析出物不会影响药品质量。

3.3兼容性试验

“溶出物/析出物试验”的是验证除菌过滤器对过滤药液质量的影响。而“兼容性试验”则主要考察过滤药液对除菌过滤器性能的影响。

除菌过滤器的性能一般包括：其允许药液通过的能力（即：过滤量和药液的流速）、物理特性（即：在极限的温度下，能承受的极限压力）以及去除药液中杂质的能力（即：截留能力，包括颗粒物、细菌及特殊物质）。评估除菌过滤器是否受到影响可通过过滤前后的完整性、目视外观检查、过滤前后的重量、滤膜拉伸强度变化及滤膜电镜扫描检测等方法来确认。

完整性测试法是非破坏性且最为常用确认除菌过滤器除菌效率的方法。生产厂家通过滤器完整性检测和细菌挑战试验获得的相关技术参数，会对不同规格及型号的除菌过滤器规定物理限值。企业用户也可以滤器说明书及相关技术报告为基础，用其他工艺流体设计并实施试验，如最终通过完整性检测，也可确认该工艺流体在使用该除菌过滤器时的物理限值。此外，滤器的目视外观检查以及物理强度也应作为兼容性试验的考察因素。其中物理强度主要体现在：滤膜、支撑层、外壳、密封用垫圈等。当除菌过滤过程中滤器承受极限温度、极限的上下游压力和较长的过滤时间，而后未观察到滤器所有部件有软化、破裂、变形等现象，也可说明试验的物理限值满足药液和除菌过滤器的兼容性要求。特别注意：对于重复使用情况下的过滤器，因为过滤器经多次重复使用[9]后，完整性数据由于滤器有潜在的硬件磨损、堵塞及变形的风险，不能得到客观体现，故首次完成兼容试验后，还应进行重复性的再验证工作。再验证过程中涉及的技术参数不可超过已验证确定的物理限值。而具有相同成分、仅仅浓度不同的同一系列药品，它们的性质和工艺条件对兼容性的影响相似，最高浓度可以作为兼容性验证的最差条件，可采用浓度最高的一种产品代表该系列中的所有产品，用该产品的验证来涵盖整个系列的产品[10]。此外，长期清洗、灭菌、使用也会对除菌过滤器造成物理或化学方面的破坏，也因此应对周期性的使用次数加以限定，如重复验证N次后，发现药液有溶出物或滤器完整性不合格，则应对每次使用过程的技术参数进行对比，通过风险评估确认对药液和滤器没有质量影响的使用次数，并写入相关文件中。

3.4吸附性试验

吸附性试验，是药液某些成分粘附在除菌过滤器上的过程，可能影响药液的浓度及组分。其中吸附性的材料主要来源于滤器的滤膜、支撑层、外壳等。

在试验开始前应根据细菌截留试验、溶出物/析出物试验、兼容性试验等相关数据建立除菌过滤器的前处理方法，如清洗方法（清洗介质、清洗介质的使用量、清洗的最高温度、清洗滤器上下游的极限压力、流量控制）、灭菌方法（一般选择高压蒸汽灭菌法：温度121℃-124℃，灭菌时间30min），并确认过滤前滤器完整性，然后使用各组分浓度趋于质量标准下限的待过滤药液通过除菌过滤器，过滤后首先确认除菌过滤器完整性，然后再取样检测药液各组分浓度是否合格；另应考虑滤器吸附的物质也许并不属于质量标准的控制范围，故必要时还应选择各组分浓度趋于质量标准上限的待过滤药液重复上述试验，最后根据试验数据进行风险评估，证明待过滤药液通过除菌过滤器后不因吸附作用影响其质量标准。

3.5完整性检测

除菌过滤器完整性是说明滤器是否完好的重要指标，客观反映过滤药液的无菌性。滤器在出厂前进行的细菌截留试验，是一种破坏性的试验方法，不可运用于生产工艺中，而非破坏性的滤器完整性是在不损坏滤器物理结构的前提下，确认是否可能影响其截留性能的试验，2010版《药品生产质量管理规范》规定除菌过滤器完整性常用的测试方法包括：扩散流试验、起泡点试验和压力保持试验。

扩散流试验：本试验基于溶解、扩散原理，是单位时间内上游气体基于溶解扩散原理通过润湿后滤膜的体积。首先用润湿介质将滤膜完全润湿，然后用压缩空气于滤器上游加压（一般用规定泡点80%的压力），此时气体由于高压会溶解至润湿液体中，并经过扩散作用，在除菌过滤器下游将其收集，并计算体积，常用单为：mL/min。此方法一般用于过滤面积≥2000cm2的除菌过滤器。

起泡点试验：本试验基于毛细管原理，是液体克服表面张力被完全挤出滤膜最大滤孔所需要的上游压力。首先用润湿介质将滤膜完全润湿，然后用压缩空气于滤器上游逐渐加压，当有气泡均匀通过滤膜被收集时，此时上游所用的压力即为起泡点值，常用单为：mbar。此方法一般用于过滤面积＜2000cm2的除菌过滤器。

压力保持试验：本试验可基于              扩散流试验、起泡点试验来检测上游单位时间内压力的变化值。

以上三种完整性测试方法的关键都是滤膜的润湿，滤膜润湿不完全，会导致其测试结果出现假阳性。一般除菌过滤器的生产厂家仅提供关键的技术参数，如：测试所用的方法和标准（例：起泡点法≥3450mbar）。但详细的润湿方法，还应由生产企业自行验证，验证的内容为完整性测试前的处理流程：如：滤膜润湿的介质、介质的润洗量、润洗时上下游的压力上限、润洗温度上限，连接完整性测试仪的要求等。另有一种特殊情况，是药液除菌过滤后直接对滤器进行完整性检测，当然此方法要进行方法学验证，同时也要考虑药液的浓度极限范围、温度极限范围、过滤量的上限等因素，最终要形成报告和标准操作规程。

4. 液体除菌过滤工艺

除菌过滤工艺分为单个无菌过滤器的设计和两个或多个无菌过滤器的串联 设计[11]。单级除菌过滤工艺：即在靠近灌装点安装除菌过滤器，此方法成本低，但实际生产中质量风险会很高，因为制剂灌装的药液不可回收，一旦除菌过滤器完整性不合格，药液有不可逆的被污染的风险；序列过滤工艺：是采用两个或两个以上孔径相同或孔径逐级递减的过滤工艺，此方法成本较高，实际生产质量风险低，但要求所有滤器全部通过完整性，才可放行过滤后药液，使操作相对不便，工艺时长增加；冗余过滤工艺：是采用两个0.22μm孔径的除菌级过滤器串联的过滤工艺，最为靠近灌装点的一级称为主过滤器，其下游的过滤器称为冗余过滤器。此方法成本相对适中，实际生产质量风险低，且主过滤器通过完整性即可放行过滤后药液，若结果不合格，也可检测冗余过滤器完整性，合格后也可放行过滤后药液，但是其验证较为复杂，因为要有相关数据确保两个除菌过滤器之间的连接管路无菌，才可说明此过滤工艺安全有效。

生产企业还应针对无菌过滤工艺单独进行除菌过滤（系统）验证，其中包括系统的清洗、压力保持试验、滤器使用前完整性检测、系统流通蒸汽灭菌（利用生物指示剂：嗜热脂肪芽孢杆菌，结合化学指示剂等、灭菌后使用的有效时长）、药液的除菌过滤（可评估药液对除菌过滤影响的关键指标，选择过滤溶液代替，或与工艺进行同步性验证）、滤器使用后完整性检测等，验证成功后方可用于生产。

除菌过滤系统验证成功后，在生产过程还应对除菌过滤器前药液进行取样检测微生物限度，合格标准应≤10CFU/100mL；除菌过滤后药液也应取样检测无菌。

5.液体除菌过滤技术总结

因为除菌过滤是药液无菌保障的重要工艺，所有首次确认和验证后还应根据产品质量回顾分析情况进行再验证，确保其始终能够达到预期结果[12]，充分保证过滤后药液的无菌性、安全性。

参考文献

[1]Parenteral Drug Association（PDA）．Sterilizing filtration of liq-uids，technical report no．26[R]．2008．

[2] FDA．Guidance for industry: sterile drug products produced by a-septic processing-Current Good Manufacturing Practice．Section IX．Validation of Aseptic Processing and Sterilization: 20-30 [S]．2004．

[3] 国家食品药品监督管理局. 药品生产质量管理规范（2010年修订）[S]．2010：附录1．

[4] SEGERSP，VANCANNEYT M，POTB，etal．Classification of Pseudomonas diminuta Leifson and Hugh，1954 and Pseudomonas vesicularis Busing，Doll and Freytag，1953 in Brevundimonas gen．nov．as Brevundimonas diminuta comb．nov．and Brevundi- monas vesicularis comb．nov．respectively[J]．Int J Syst Bacte- riol，1994，44: 499-510．

[5] Parenteral Drug A ssociation （PDA）．Sterilizing filtration of liq-uids，technical report no．26 [S]．2008．

[6] Bio-Process System A lliance Extractables and Leachables Sub-committee．Recommendations for extractables and leachables tes-ting[J]．Bio-process Int，2007，5（11）: 36 - 49．

[7] Bio-Process System A lliance Extractables Subcomm ittee．BPSA Recommendations for testing and evaluation of extractables from single-use process equipment[S]．2010．

[8] WAKANKAR AA，WANG YJ，CANOVA-DAV ISE，etal．On develop ing a process for conducting extractable-leachable assess-ment of components used for storage of biopharmaceuticals[J]．J Pharm Sci，2010，99 (5) : 2209 - 2218．

[9] MARTIN J. Considerations on re-use of sterilizing-grade filters [J]. Pharm Technol，2008，32 （Supp l）:S6-S14．

[10] Parenteral Drug Association（PDA）．Sterilizing filtration of liq-uids，technical report no．26 [R]．PDA JPharm Sci Technol，2008，62 ( Supp l 5) : S12 - S18．

[11] Parenteral Drug Association: Points to Consider for Aseptic Processing: Part1[C]，2015．

[12] EMA．EU guidelines to good manufacturing practice[S]．Annex 15，qualification and validation，2001．