大米中黄曲霉毒素B1和赭曲霉毒素A的测定

大米中黄曲霉毒素B1和赭曲霉毒素A的测定

周考根 ,陈瑞霞 ,韩娜

海南省食品药品检验所琼海分所， 海南 琼海 571433

摘要：建立了大米中黄曲霉毒素B1和赭曲霉毒素A同时处理的免疫亲和柱净化-高效液相色谱方法。样品经过甲醇-水（体积比为70:30）提取，通过免疫亲和柱富集和净化，采用依利特 Hypersil ODS2色谱柱（4.6×150mm,5μm），以乙腈：2%冰乙酸溶液为流动相，等度洗脱，采用高效液相色谱结合荧光检测器检测。黄曲霉毒素B1和赭曲霉毒素A检出限分别为0.024和0.063μg/kg，标准曲线的线性范围分别为0.10～40.0和1.00～100.0ng/mL，大米样品中，平均加标回收率为79.5.%～88.0%，方法精密度为2.5%～5.3%。

关键词：黄曲霉毒素B1；赭曲霉毒素A；免疫亲和柱；高效液相色谱

目前全世界粮谷、饲料中出现真菌毒素污染的范围极广，除了降低农作物的产量及质量对畜牧产业造成显著的经济损失外，部分真菌毒素还具有致癌性和致畸胎性，可经食物传至人类[1]。黄曲霉毒素(AFT)和赭曲霉毒素(OT)是真菌毒素中毒性最大的两类毒素[2]，在天然污染的食品中以黄曲霉毒素B1最为多见，其毒性和致癌性也最强。1993 年AFTB1 被国际癌症研究机构(IARC)列为一类致癌物，赭曲霉毒素中的赭曲霉毒素A(OTA)则被列为二类致癌物 [3]。有资料表明AFT和OTA常常同时污染同一粮食作物，而且存在毒性的加和效应[4]。目前对食品、农产品中AFT和OT等真菌毒素的单独检测方法主要有薄层色谱法、酶联免疫吸附法、荧光光度法和高效液相色谱法等[5]，但有些方法试剂损耗严重且操作耗时，工作量大，设备昂贵成本高，不能在一般实验室大面积推广使用。目前同时检测多种真菌毒素的液相色谱法，在前处理技术、回收率、灵敏度等方面依然存在不足。国家标准提取、净化根据不同极性的真菌毒素采用不同的前处理方法[6]，操作复杂时间长，成本高。本实验以大米为研究对象采用免疫亲和层析净化-高效液相色谱法检测AFTB1和OTA，旨在建立一套成本低，操作快速、简便，净化效果好的AFTB1和OTA检测方法，为粮食谷物中AFTB1和OTA 的限量检测提供一定的参考依据，提高食品安全性，意义重大。

1材料与方法

1.1材料、试剂与仪器

大米样品：米店购买和加工厂抽取；真菌毒素免疫亲和柱：Pribolab。

黄曲霉毒素B1标准溶液(2μg/mL)、赭曲霉毒素A标准溶液(100μg/mL)：北京坛墨质检科技有限公司；色谱纯甲醇、乙腈：TEDIA。

Ultimate3000 DGLC双三元梯度液相色谱仪（配有可变波长荧光检测器、紫外检测器和Chromeleon7色谱工作站） 美国赛默飞世尔科技公司；光化学衍生器 LabTech公司；FA2104 型电子分析天平 上海舜宇恒平科学仪器有限公司；HTY HOMO761匀浆仪 杭州泰林生物技术设备有限公司；飞鸽牌GL-20G-II高速冷冻离心机 上海书培实验设备有限公司；多管式涡旋振荡器 德国Heidolph。

1.2方法

1.2.1标准系列工作溶液的配制

分别将AFTB1和OTA标准溶液配制成标准储备液，根据使用需要，再用初始流动相稀释成合适浓度梯度的标准工作液（含AFTB1浓度为0.1ng/mL、0.5ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL、20.0ng/mL、30.0ng/mL、40.0ng/mL，OTA浓度为1.0ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL、20.0ng/mL、40.0ng/mL、50.0ng/mL、80.0ng/mL、100.0ng/mL的系列标准溶液）。

1.2.2色谱条件

色谱柱：依利特 Hypersil ODS2（4.6×150mm,5μm）；流速：1mL/min；柱温：35℃；进样量：20μL；液相色谱条件见表1

表1  液相色谱条件

1.2.3提取与净化

1.2.3.1、提取：称取 5g试样（精确至0.01 g）于50 mL离心管中，加入1g氯化钠和20mL甲醇-水溶液（70+30），高速涡旋混匀5min，10000r/min离心5min。取上清液备用。

1.2.3.2、净化：准确移取4mL上清液，加入10mLPBS缓冲液，混匀。免疫亲和柱内液体放弃后，将上述样液转移至20mL注射器中，调节下滴速度，控制样液以1mL/min-3 mL/min的速度稳定下滴。待样液滴完往注射器加入10mLPBS缓冲液淋洗后，再加入10mL水淋洗，水淋洗完后吹干免疫亲和柱。加入1mL2%乙酸-甲醇溶液洗脱，洗脱前将柱帽堵上，浸泡抗体1min，洗脱完后吹干免疫亲和柱。混匀后0.22μm滤膜过滤后上机。同时做空白实验。

2结果与讨论

2.1 提取净化条件的选择

2.1.1提取溶剂的选择

AFTB1 和OTA 易溶于如甲醇、乙睛、丙酮等极性溶剂而不溶于非极性溶剂中，一般使用有机溶剂作为提取液。提取液中少量水可以湿润基质，增强有机溶剂在样品中的渗透能力，提高萃取效率[7] 。因此，通常采用有机溶剂与水的混合溶液作提取剂。参照国标方法分别以甲醇-水(V/V，70:30和80:20)和乙腈-水(V/V，84:16和60:40)为提取剂对大米样品中AFTB1和OTA进行提取，结果表明，用四种提取剂AFTB1提取回收率均大于85%，而乙腈-水(V/V，84:16和60:40)OTA提取回收率不足50%。后改用甲醇-水(V/V，70:30和80:20) 为提取剂对大米样品中的OTA进行提取回收率提升到65%以上。因此最终考虑到降低提取剂的毒性选择以甲醇-水(V/V，70:30)作为提取剂。

2.1.2提取方式的选择

大米样品经过粉碎后，毒素在米粉中的分布比较均匀，通过快速的涡旋振荡使固体样品分散，增大了样品与萃取溶剂之间的接触面积，减少毒素与样品基体之间的作用力从而实现固-液萃取分离，加强了毒素的溶解及扩散，所以有利于毒素的提取完全。摇床振荡机械振动速度相对较慢，所以很难提取完全。而均质器处理一次只能提取一个样品，操作麻烦，还可能出现交叉污染。因此选择多管式涡旋振荡器对大米样品中AFTB1和OTA进行提取，通过实验验证，涡旋震荡五分钟就能满足回收率要求，缩短了提取时间，提升了提取效率。

2.1.3净化方式的选择

免疫亲和柱通过真菌毒素与连接在柱体内的抗体结合可选择性吸附样液中的毒素，通过洗涤免疫亲和柱除去没有被结合的无关物质，从而起到非常针对性的富集净化作用。使用同厂家操作更为简便的多功能净化柱进行比对实验，AFTB1和OTA回收率都不如免疫亲和柱，因此选择免疫亲和柱对样品进行净化。

2.1.4洗脱条件的选择

通过加标实验，添加AFTB1浓度为4.0μg/kg，用1mL甲醇洗脱免疫亲和柱一次，AFTB1回收率能达到86.5%。而添加OTA浓度为10.0μg/kg，用1mL甲醇洗脱免疫亲和柱一次，OTA回收率只有68.9%。用1mL甲醇再洗脱免疫亲和柱一次，没有检出OTA。后面改用1mL2%乙酸-甲醇溶液洗脱免疫亲和柱一次，回收率达到86.6%。另外用复合的免疫亲和柱不如单个免疫亲和柱洗脱效果好，AFTB1回收率影响不大，OTA回收率稍低点。为了提高提取效率最终确定用复合的真菌毒素免疫亲和柱进行净化，1mL2%乙酸-甲醇溶液同时洗脱AFTB1和OTA。

2.2 线性范围及检出限

分别用AFTB1和OTA 的系列标准溶液按选定的色谱条件测定，其质量浓度(x)与峰面积(y)具有良好的线性关系，结果见表2。再根据3倍信噪比的峰响应值，得出此方法检出限。

表2  真菌毒素的线性回归方程及检出限

由上表可知，AFTB1和OTA标准曲线相关系数均大于0.999，线性良好，两种毒素的检出限均低于国标方法检出限。

2.3回收率实验

在大米中添加表3中所列的三组浓度水平的AFTB1和OTA，按上述实验条件进行回收试验，测得的回收率和精密度结果见表3。

表3 加标回收率和精密度（n=6）

注：括弧中为用1mL2%乙酸-甲醇溶液洗脱对应毒素的结果。

从回收率结果表明，不同极性的真菌毒素，通过方法的优化，选择合适的提取溶剂和提取方式，选择1mL2%乙酸-甲醇溶液作为洗脱试剂可提高OTA的回收率，通过复合的免疫亲和柱同时净化AFTB

1和OTA也能满足回收率要求。最后确定的方法可同时处理和检测AFTB1和OTA，可降低成本，提升实验效率。

2.4与国标方法对比

通过与国标方法前处理过程的梳理比较和方法验证，本方法在试剂使用、时间、成本及检出限等方面都满足现行国标要求，方法比较结果见表4 。

表4 本方法与国标方法比较

从表4 可以看出，AFTB1和OTA 的同时处理可以避免试剂的重复使用，降低成本，通过前处理方法的简化优化，减少工作量，节约时间，同时检出限和精密度等都满足国家检测标准要求，适用于大米中AFTB1和OTA 的测定。

运用所建立的AFTB1和OTA检测方法，对市售的10批大米样品，加工厂抽的6批大米样品，一份自产大米和一份米粉原料大米进行测定，结果所测的18个大米样品OTA均未检出，AFTB1有8批检出，检出率为44.4%，两批样品超过限量标准。大米中OTA的检出率较低，在同时测定谷物中AFTB1和OTA可用所建立检测方法进行快速检测，采用复合免疫亲和柱进行净化，可大大缩短分析时间提高实验效率。对于AFTB1阳性样品可采用单克隆抗体免疫亲和柱进行净化，回收率更高，可提高结果准确性，以避免错检漏检。

3结论

本研究采用免疫亲和柱层析净化-高效液相色谱法检测AFTB1和OTA，适用于大米等粮谷类食品的检测分析。粉碎的大米样品过实验筛（孔径小于2mm）后混匀，5g样品经过20mL甲醇：水（70:30，V/V）高速涡旋提取5min，4mL上清液过复合免疫亲和柱富集后，10mLPBS缓冲液和10mL水淋洗后，用1mL2%乙酸-甲醇溶液洗脱。高效液相色谱仪采用Hypersil ODS2色谱柱（4.6×150mm，5μm），以乙腈：2%冰乙酸溶液=50：50为流动相等度洗脱，AFTB1采用柱后光化学衍生，荧光扫描最大激发波长360nm，最大发射波长440nm。OTA荧光扫描最大激发波长333nm，最大发射波长460nm。

AFTB1和OTA分别在浓度0.10～40.0和1.00～100.0ng/mL范围内成线性相关，相关系数R2均大于为0.999。根据3倍信噪比的峰响应值，确定AFTB1和OTA检出限分别为0.024和0.063μg/kg。按照此方法对大米样品进行加标回收实验，回收率为79.5%～88.0%，精密度也符合要求。

本方法具有较高的灵敏度、精密度和回收率。样品前处理比传统方法简便快捷，检测时间短，净化效果好。在试剂使用、时间、成本及检出限等方面都符合现行真菌毒素国家检测标准要求，可以满足我国对粮食中AFTB1 和OTA 的限量检测要求。

参考文献

[1]李军, 于一茫, 田苗, 等. 免疫亲和柱净化- 柱后光化学衍生- 高效液相色谱法同时检测粮谷中的黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A[J]. 色谱, 2006, 24(6): 581-584.

[2] 吴永宁. 现代食品安全科学[M]. 北京: 化学工业出版社, 2003: 27.

[3] 王若军, 苗朝华, 张振雄, 等. 中国饲料及饲料原料受霉菌毒素污染的调查报告[J]. 饲料工业, 2003, 24(7): 53-54.

[4] 王刚, 杨汉春. 黄曲霉毒素B1 和赭曲霉毒素A 对商品肉鸡ND 疫苗免疫的影响[J]. 中国兽医杂志, 2008, 44(11): 30-32.

[5] 杨洁彬, 王晶, 王柏琴. 食品安全性[M]. 北京: 中国轻工业出版社,2002: l45.

[6]黎睿，谢刚，王松雪.高效液相色谱法同时检测粮食中常见8种真菌毒素的含量[J].食品科学,2015(6):206-210

[7]杨琳, 张宇昊, 马良. 高效液相色谱法同时检测粮谷中的黄曲霉毒素和赭曲霉毒素[J]. 食品科学, 2011(24):250-254.