多穗柯叶不同采收期HPLC图谱比较研究

多穗 柯叶 不同采收期 HPLC 图谱比较研究

贺莲1

广东食品药品职业学院，广东 广州 510520

摘要：目的 利于高效液相色谱，比较不同月份采收的多穗柯叶中共有峰总峰面积差异，确定其最佳采收期。方法 色谱柱：Kromasil (C₁₈ 250mm*4.6mm,5μm)；流动相：甲醇-0.1％甲酸,梯度洗脱：0-20min甲醇为18%→35%；20-60min甲醇为35%；60-72min甲醇为35%→40%；检测波长：285nm；流速：0.8mL•min^-1；柱温：25℃；进样量20μL。结果 不同采收期的多穗柯叶的成分组成变化不显著，但其各指标成分含量差异明显。结论 在4、6、10三个月份中多穗柯叶指纹图谱的共有峰总峰面积出现峰值，这对最佳采收时间的确定有一定指导作用。

关键词：多穗柯、采收期、高效液相色谱

多穗柯^[1,2]，来源于壳斗科石柯属Lithocarpus polystachyus (Wall.) Rehd。其根、叶及果实都可以入药，根、叶一年四时均可以采摘，秋天采集果实，分别晒干备用，种子含淀粉；嫩叶可制甜茶^[3]。多穗柯嫩叶的黄酮类成分和酚酸类成分含量比较高，所以嫩叶常被用作茶叶，其提取物常被作为增甜剂和食用色素。每年“谷雨”和“霜降”前后可以采摘嫩叶2～3次。在我国制定的“中药材生产质量管理规范”（Good Agricultural Practice of Medicinal Plants and Animals,GAP）中，中药材采收是一个重要环节^[4]，并具体要求必须明确中药材的最佳采收期。确定中药材的最佳采收期，必须将药材的有效成分的积累动态和药用部位的产量变化结合起来综合考虑。药材有效成分的多少会直接影响到药材的质量，而其药用部位的产量将影响药农的经济效益。本实验收集一年12个月的多穗柯叶，同时以其指纹图谱^[5]的共有峰总峰面积为指标，以确定其最佳采收期。

1.实验材料

1.1实验仪器

日本岛津Shimadzu高效液相色谱仪(LC-20AT高效液相泵，SIL-20A 自动进样器，SPD-20A 二极管阵列检测器，CTO-20A柱温箱)；高效液相色谱柱：Kromasil (C₁₈ 250mm*4.6mm,5μm)柱；万分之一Sartorius BP110S 电子天平（德国sartorius公司）；十万分之一Sartorius CP225D 电子天平（德国sartorius公司）。

1.2试剂

分析用甲醇（色谱级，德国默克公司），甲酸（分析级，天津大茂化学试剂厂），乙醇（分析级，广州东巨化学试剂厂），怡宝纯净水。

1.3实验样品

多穗柯药材采于江西吉安，经广州中医药大学新药开发研究中心陈建南研究员鉴定为壳斗科植物Lithocarpus polystachyus Rehd的干燥叶，标本存放于新药开发研究中心药材库。

根皮苷对照品（自制，面积归一化法检测纯度为98.55％）。

2方法与结果

2.1色谱条件

色谱柱：Kromasil (C₁₈ 250mm*4.6mm,5μm)；流动相：甲醇（A）-0.1％甲酸（B）；梯度洗脱：0-20min甲醇为18%→35%；20-60min甲醇为35%；60-72min甲醇为35%→40%；检测波长：285nm；流速：0.8mL•min^-1；柱温：25℃；进样量20μL。

2.2 供试品溶液的制备

精密称取多穗柯叶粗粉（过二号筛）5.00g，加入8倍量的50％乙醇，80℃回流提取3次,每次1.0h，冷却，混合均匀三次提取液，过滤，滤液置于250mL容量瓶中，用50％乙醇定容，过0.45μm微孔滤膜，即得供试品溶液。

2.3方法学考察

2.3.1精密度考察

精密吸取供试品溶液20 μL，连续进样5次，各个共有峰相对6号峰根皮苷的相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3％，表明精密性良好。

2.3.2重现性考察

取同一批样品5份，分别制备供试品溶液，进样分析，各个共有峰相对6号峰根皮苷的相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3％，表明重现性良好。

2.3.3稳定性考察

精密吸取供试品溶液10 μL，分别在0，6，12，24，36，48小时进样测定分析，各个共有峰相对6号峰根皮苷的相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3％，表明供试品溶液在48h内稳定性良好。

2.4 不同采收期药材HPLC特征指纹图谱的比较

取不同采收期多穗柯药材，按2.2项下方法处理制备供试品溶液，并按2.1项下的色谱条件进样测定分析，记录各共有色谱峰的峰面积。

图1 不同采收期多穗柯叶HPLC特征指纹色谱图

（S1一月; S2二月; S3三月; S4四月; S5五月; S6六月; S7七月; S8八月; S9九月; S10十月; S11十一月; S12十二月）

图2 不同采收期多穗柯叶共有峰总峰面积变化趋势图

3讨论

采收时节和药材质量有着密不可分的关系^[6]，唐·孙思邈 《千金翼方》云: “凡药,皆须采之有时…… 若不依时采之,则与凡草不别,徒弃功用,终无益也。”本研究首次利用高效液相色谱，分别对十二个月份采收的多穗柯叶共有峰峰面积进行分析对比。结果表明，不同采收期的多穗柯叶指标成分含量存在差异，这对实际生产中多穗柯叶采收时间的选择有着一定的指导作用。

参考文献：

[1] 雷鸣,徐应淑,徐凡,龙隆,龚其海,高健美.多穗石柯化学成分及药理作用研究进展[J].中药药理与临床,2017,33(06):176-180.

[2] 中国科学院昆明植物研究. 云南植物志 [M]. 科学出版社, 2010:306.

[3] 杨娟. 两种甜味物质的活性成分研究[D].昆明理工大学,2016.

[4] 董百惠,林志健,李丽玉,王红坡,张冰.中药采收与产地加工不良现象综述[J].北京中医药,2015,34(04):342-343.

[5] 赵娟,谢世静,赵兴华,郭明,曹长红,陈俊荣.中药指纹图谱质控方法研究进展[J].云南中医中药杂志,2020,41(01):82-86.

[6] 王明喜.浅谈中药的采收与质量的关系[J].中医临床研究,2016,8(13):116-117.

基金项目：学院自然科学研究项目（2018ZR007,2017ZR015）

作者简介：贺莲（1976—），女，硕士，助理研究员，从事中药新药研发及教学，E-mail：huangnn421@163.com。

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