益气活血解毒方对HUVEC内VEGF表达的影响

益气活血解毒方对HUVEC内VEGF表达的影响

李晓星

四川省成都市大邑县中医医院四川省大邑县611330

【摘要】目的：观察益气活血解毒方对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）内血管内皮生长因子（VEGF）的影响。方法：采用免疫细胞化学法检测HUVEC内VEGF的表达。结果：益气活血解毒方在10%—20%浓度范围内，可减低HUVEC内VEGF的表达，且随着中药浓度的增加，降低作用越明显。结论：益气活血解毒方（10%—20%）可降低HUVEC内VEGF的表达。

【关键词】益气活血解毒方；内皮细胞；血管内皮生长因子

EffectofYiqihuoxuejieduFormulaontheexpressionofVEGFinHUVEC

【Abstracts】Objective：ToobservetheeffectofYiqihuoxuejieduFormulaonvascularendothelialgrowthfactor（VEGF）inhumanumbilicalveinendothelialcells（HUVEC）.Methods：ImmunocytochemistrywasusedtodetecttheexpressionofVEGFinHUVEC.Results：In10%-20%concentrationrangeofYiqihuoxuejieduFormula，canreducetheexpressionofVEGFinHUVECandwiththeincreasingconcentrationofChinesemedicine，reducetheeffectismoreobvious.Conclusion：YiqihuoxuejieduFormula（10%-20%）canreducetheexpressionofVEGFinHUVEC.

【Keywords】YiqihuoxuejieduFormula；Endothelialcell；Vascularendothelialgrowthfactor

益气活血解毒方是依据益气、活血、解毒组方原则构成，是多年应用的一种有效改善结肠癌生活质量的方剂，由人参、薏苡仁、莪术、红藤、鸦胆子、喜树果等组成。肿瘤血管生成是指肿瘤细胞诱导的毛细血管生长及肿瘤血液循环建立的过程，它受多种促血管生成因子及抑制因子的作用，并有多种酶、细胞粘附分子的参与，其中血管内皮生长因子（VEGF）是目前已知最强烈的血管发生蛋白，它在结肠癌的生长、转移过程中起着重要作用[1]。本实验通过探讨益气活血解毒方对HUVEC内VEGF表达的影响，进一步影响血管生成，最终影响结肠癌的发生与转移。

1实验材料

1．1细胞株及动物

人脐静脉内皮细胞（HUVEC），四川大学华西妇儿院细胞培养室提供。SD大鼠30只，体重140—180g，雌雄各半，四川省中医药科学院实验动物中心提供。

1．2试剂及药物

RPMI-1640培养基、胎牛血清、0.25％胰蛋白酶：均购自成都哈里生物工程有限公司。冷磷酸缓冲液（PBS）：自配。中药人参16g、薏苡仁24g、莪术24g、红藤24g、鸦胆子16g、喜树果16g购自四川省中医院。

2实验方法

2.1细胞培养

HUVEC正常用含10％新生牛血清的RPMl-1640培养液，在37℃、5％C02饱和湿度的培养箱中培养，待细胞生长至约90％汇合状态时，用含0.25％胰蛋白酶消化液进行消化，倒置显微镜下观察细胞质回缩、细胞间隙增大后，即加入含10％新生牛血清的RPMI-1640培养液进行终止，按一定细胞数进行传代。实验时取对数生长期的细胞进行实验。

2.2药物血清的制备

本实验需制备三组实验血清：无药血清组、阳性对照药物5-FU血清组和益气活血解毒方血清组。

取SD大鼠30只，雌雄各半，体重140-180g，按体重分层后在随机分为3个组，每组10只，分别用于制备无药血清组，5-FU血清组，中药血清组。并进行动物分组均衡性分析，见表1。

各组体重总体均数无差异（P>0.05），分组具有均衡性。

具体制备方法：将益气活血解毒方浓煎至每毫升含1g生药的汤剂，于4℃冰箱保存。制备无药血清组的大鼠每日灌胃生理盐水2ml/只，制备中药血清组的大鼠每日按8.96g/Kg/只灌胃，以上二组均每日灌胃3次；制备5-FU血清组的大鼠每次按25mg/Kg/只腹腔注射，一日一次，各组均连续给药5天。于最后1次给药后2h腹主动脉采血，将装有SD大鼠血液的真空采血管置于离心机中，以3000rpm、20min离心，合并同组动物血清，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，将制备的血清置于-20℃冰箱保存备用，临用前用完全培养液培养液调成所需浓度供实验用。

2．3分组

1）空白组：HUVEC细胞培养的同时用20%无药血清进行干预。

2）中药低剂组：HUVEC细胞培养的同时用10%含药血清进行干预。

3）中药中剂组：HUVEC细胞培养的同时用15%含药血清进行干预。

4）中药高剂组：HUVEC细胞培养的同时用20%含药血清进行干预。

5）5-FU组：HUVEC细胞培养的同时用20%5-FU动物血清进行干预。

2．4免疫细胞化学法检测HUVEC内VEGF的表达

取第4代对数生长期HUVEC采用0.25％胰蛋白酶消化液进行消化，制备成单细胞悬液，浓度为1x105个/ml，吸取400ul接种到24孔培养板上，在37℃、5％C02饱和湿度的培养箱中培养24小时，待细胞完全贴壁后，按以上分组分别加入刺激物，此始起记为0时刻，继续培养24h后，用少量PBS液洗3次，在95％的乙醇中固定15分钟后，分别用免疫细胞化学法检测培养细胞VEGF的表达。各组取平均值和标准差进行统计学处理。

2．5统计学方法：所有项目均进行6次实验，结果取平均值，采用SPSS18.0统计包，对实验数据作单因素方差分析。

3结果

与空白对照组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；

与5-FU组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

与空白组比较：5-FU组、中药低剂组、中剂组、高剂组与空白组比较均有差异，且中药中、高剂组降低HUVEC内VEGF表达的作用更明显。与5-FU组比较：中药中、高剂组与5-FU组比较有差异，表明随着中药浓度的增加，降低作用越明显。

4讨论

中医认为结肠癌是因脏腑失调，正气虚弱，气滞血瘀，邪凝毒聚而成。针对正虚邪实的病机特点，我们选用人参、薏苡仁健脾益气，为君药；莪术、红藤破血祛瘀，行气止痛，共为臣药；鸦胆子、喜树果清热解毒，为佐药；甘草为使，调和诸药。全方具有健脾益气、理气活血、解毒散结的作用。

肿瘤生长依赖于血管生成。肿瘤血管生成在肿瘤从良性向恶性的转变、癌细胞进入血液循环、转移灶的发展和裂中起着重要破作用，涉及肿瘤从形成到转移的全过程[2]。近年来，发现某些药物，在小剂量、高频率的给药方式下可以选择性地显著抑制肿瘤组织内新生血管内皮细胞的生长，使肿瘤细胞因为血供不足而生长受阻。这种特殊的给药模式，药物的作用靶位已经不是肿瘤细胞，而是新生的血管内皮细胞，这就成为小剂量化疗（metronomicchemotherapy）或血管生成化疗（antiangiogenicchemotherapy）[3，4]。

临床经验表明，该方可改善结肠癌患者的生存质量，本实验再次体验了该治则的正确性。说明益气活血解毒方治疗结肠癌其机制可能是降低其细胞内VEGF的表达，从而抑制血管的形成，最终影响结肠癌的生长、转移、发挥抗癌作用。

参考文献：

[1]刘占奎，张超等.环氧化酶-2对结肠癌肝转移瘤新生血管生成影响的实验研究.中国新医药.2004，3（6）：22～24.

[2]ShimizuK，AsaiT，OkuN.Antineovascullartherapy，anovelantiangiogenicappoach.ExpertOpinTherTargets.2005Feb；9（1）：63-76.

[3]BrowderT，ButterfieldCE，KralingBM，andFolkmanJ.antiangiogenicschedulingofchemotherapyimprovesefficacyagainstexperimentaldrug-resistantcancerRes，2000；60；1878-1886.

[4]HanahanD，BergersG，andBergslandE.Lessismore，regularly：metronomicdosingofcytotoxicdrugscantragettumorangiogenesisinmice.JClinInvesting，2000；105；1045-1047.