高效液相色谱法测定更年乐胶囊中淫羊藿苷的含量

高效液相色谱法测定更年乐胶囊中淫羊藿苷的含量

刘晓凤

哈尔滨快好药业有限公司150000

【摘要】目的：测量更年乐胶囊中淫羊藿苷的含量。方法：HPLC即采用高效液相色谱法，其中色谱柱为C18（5μm、4.6mmX200mm），流动相水与乙腈的比例为70：30，其中流速为每分钟1.0毫升，检测波长为270纳米。结果：在0.204至0.816μg的范围内淫羊藿苷线性关系良好，r=0.9999.此时RSD是1.58%，平均回收率是98.77%。结论：利用高效液相色谱法对更年乐胶囊进行检测，具有操作简单、高灵敏度的特点，适合对更年乐胶囊中淫羊藿苷含量进行检测。

【关键词】HPLC；淫羊藿苷；对照品溶液

更年乐胶囊中的主要成分有牡蛎、金樱子、人参、淫羊藿、车前子、知母、黄柏等，并具有调补冲任、养心养肾的疗效。可用于治疗更年期常出现的心悸、耳鸣、烘热出汗、夜不能寐、腰酸背痛、烦躁易怒等症状。本文针对更年乐胶囊的药方中的成分，主要针对淫羊藿中所含有的淫羊藿苷的含量作为主要指标，并通过高效液相色谱法对更年乐胶囊进行检测，从而测得其中淫羊藿苷的含量。

一、HPLC-高效液相色谱法

1高效液相色谱法具有的优点

与其他谱法相比具有以下优点：①高分离率(应用10μm以下规则均匀的极细颗粒为固定相，所以传质阻抗小，柱效高,一般在1×103~5×105n/m)；②高速(采用2×103~3×104kPa的高压输液泵输送液体流动相，使其具有高流速,数分钟至几十分钟可完成试样分析)；③自动化操作，重复性高；④高效相色谱柱可反复使用；⑤高灵敏度(广泛使用了高灵敏检测器,只需要试样10-7~10-2g)。

2高效液相色谱法分类

2.1液-液分配色谱法（liquid-liquidchromatography)

LLC根据流动相和固定相的极性不同又可分为，①正向LLC：流动相极性<固定相极性，极性小的组分先流出色谱柱，适合极性物质分离。②反向LLC：流动相极性>固定相极性，极性大的组分先流出色谱柱，适合非极性物质分离。

2.2液-固吸附色谱法（liquid-solidadsorptionchromatogramphy）

在吸附色谱中，组分分子和流动相分子对吸附剂（固定相）表面产生竞争性吸附，利用组分和固定相吸附力的不同而分离。

2.3离子交换色谱法(ionexchangechromatography)

离子交换剂上可解离的离子与流动相中组分离子进行可逆的离子交换，利用试样中不同组分与离子交换剂具有不同的亲和力而将它们分离的方法。

二、仪器和试药

此次试验主要用到的仪器有紫外检测器、化学工作站、以及高效液相色谱仪。其中各个仪器采用的是美国的HP1100高效液相色谱仪，VWD紫外-可见光检测器以及HP化学工作站。色谱柱为C18（5μm、4.6mmX200mm），型号为AS3120B的超声提取器。

由中国药品生物制品检定所采购的批号为0737-200011的含量测定用药品作为淫羊藿苷的对照品。

色谱纯为甲醇、乙腈。水则选用亚沸重蒸水，其他试剂则均为分析纯。更年乐胶囊采用的分别是批号为041025/041022/041020的药品。

三、方法与结果

1.色谱条件

色谱柱为C18柱分析柱（5μm、4.6mmX200mm），水与乙腈的比例为70:30作为流动相，流速为每分钟1.0毫升，检测波长为270纳米。进样量则为10μl。淫羊藿苷在该色谱条件下同其他的成分分离良好，并且空白溶液未受干扰。详见下图，即图1、图2、图3.

2.制备对照品溶液

选取适量的淫羊藿苷对照品，并进行精密的称定，在其中加入甲醇，制定出在每毫升中含有50μg淫羊藿苷的溶液，此即为对照品溶液。

3.制备供试品溶液

选取本药品约2.0g的内容物细粉，并过80目筛，进行精密的称定。放置在容积为100毫升的具塞锥形瓶内，精密加入50毫升的50%的乙醇，密塞后称量重量。经过三十分钟的超声处理后放置冷却。对于失去的重量用50%的乙醇进行补充，并摇匀。用孔径为0.45μm的微孔滤膜进行过滤，去续滤液极为供试品的溶液。

4.制备空白溶液

按照更年乐胶囊的处方组成，取处方中除淫羊藿之外的药物，即牡蛎、金樱子、人参、车前子、知母、黄柏等。并按照相关的标准和制备的工艺，制成不具备淫羊藿的空白对照品。取2.0g过80目筛并精密称定。放入容积100毫升的具塞锥形瓶中，加入50毫升的浓度为50%的酒精，塞进瓶塞后称重量。进行超声处理三十分钟后放置冷却。并用浓度为50%的乙醇补充失去的重量，摇匀后用微孔滤膜过滤，取得续滤液极为空白溶液。并分别取10μl的供试品溶液与10μl的空白溶液放入高效液相色谱仪。其检测结果表明，比较空白溶液和供试品溶液，对应的位置未出峰，因此我们可以认为空白溶液无干扰。

5.考察线性关系

精密称取5.1毫克的淫羊藿苷标准品，并放置在容积为100毫升的量瓶中，加入甲醇进行溶解稀释到刻度，并摇匀。精密的分别取4μl、6μl、8μl、12μl、16μl的对照品溶液，按照前文所记载的色谱条件注入高效液相色谱仪中，对峰面积进行记录，纵坐标为峰面积的积分值A，横坐标为淫羊藿苷的进样量C，并对标准曲线进行绘制，可得回归方程即A=4164.7C-29.352；r=0.9999。可知在0.204至0.816μg的范围内淫羊藿苷线性关系呈现良好。

6.精密度实验

精密选取10μl的淫羊藿苷对照品溶液，并连续吸取五次均为10μl的对照品溶液。此时测得的峰面积的平均值为1779，RSD是1.35%。

7.重复性实验

按前文所记载的制备供试品溶液的方法，对批号为041020的样品连续称取五次，并进行分别测定。可得出淫羊藿苷的平均含量为每粒0.33毫克，RSD是1.36%。

8.稳定性实验取

同一供试品溶液(批号041020),分别于配制后0,2,4,8,12h依法测定,峰面积平均值为1522,RSD为2.28%,表明样品溶液在12h内稳定。

9.回收率实验

采取加样回收法(按1:1加入),精密称取已知含量的同一批号样品(041020)1.0g共5份,分别精密加入浓度为1.1mg/ml的淫羊藿苷对照品溶液1ml,水浴蒸千,混合均匀,按2.3项下方法制备供试品溶液,精密吸取10ul,注人液相色谱仪,同法测定。计算平均回收率为98.77%,RSD为1.58%(n=5)。结果见表1。

10.样品测定结果

取3个批号(041020，041022，041025)的样品，每个批号3个样本，按样品溶液制备项下的方法提取，结果3个批号样品的淫羊藿苷平均含量分别是0．33，O．29，0．33m∥粒。

三、讨论

1.流动相的选报

分别选择甲醇：水(62：38)、甲醇：0．1moL／L磷酸二氢钠水(52：48)、乙腈：水(30：70)作为流动相进行实验，结果发现以乙腈：水(30：70)为流动相时，被测物分离效果较好，杂质干扰少，故选择其为本法的流动相。

2.样品制备方法曾采用70％乙醇加热回流提取及50％乙醇超声提取，结果发现50％乙醇超声提取所得杂质较少，被测成分分离效果好，且操作简便，快捷，故选择本法。实验证明，该含量测定方法简单可靠，易于操作，重现性好，可作为本品的质量控制的有效方法。

四、结语

更年乐胶囊作为中药处方药，具有调补冲任、养心养肾的疗效。对于治疗更年期常出现的心悸、耳鸣、烘热出汗、夜不能寐、腰酸背痛、烦躁易怒等具有良好效果。通过采用HPLC即高效液相色谱法对更年乐胶囊中淫羊藿苷含量的检测可知，在0.204至0.816μg的范围内淫羊藿苷线性关系良好，r=0.9999.此时RSD是1.58%，平均回收率是98.77%。并通过连续性实验等测得批号为041020的更年乐胶囊中淫羊藿苷的平均含量为每粒中含有0.33毫克。

参考文献

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