γ干扰素释放试验快速诊断肺外结核的探讨

γ干扰素释放试验快速诊断肺外结核的探讨

陈永芳1,2李晟磊1李瑞2陈裕2于永敏

陈永芳1,2李晟磊1李瑞2陈裕2于永敏2

（1郑州大学基础医学院病理教研室河南郑州450000）

（2郑州市第六人民医院呼吸五科河南郑州450015）

【摘要】目的探讨γ干扰素释放试验（T-SPOT．TB）对肺外结核快速诊断的应用价值方法采用结核杆菌感染T-SPOT．TB试剂盒对外周血标本检测，根据斑点数推测体内是否存在对结核杆菌反应的效应T细胞，对结核杆菌感染进行辅助诊断。结果结核分枝杆菌特异性T细胞阳性率，肺外结核组与两对照组比较，差异均有显著统计学意义(P<0．05)，T-SPOT．TB检测结核特异T细胞方法的敏感性为68.9％，特异性84％。结论T-SPOT．TB技术对隐性结核有诊断价值，有助于肺外结核的诊断和治疗。我市结核分枝杆菌的感染情况较为严重，在结核病防治工作中应给予充分重视。

【关键词】结核分支杆菌T-SPOT．TB肺外结核

【中图分类号】R521【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2013）38-0068-02

据“全国第五次结核病流行病学抽样调查报告”,中国是全球22个高负担国家之一，结核病人数居全球第2位。属于高疫情地区[1]。临床上常常遇到临床表现不典型的肺结核病和肺外结核病，目前用于结核病的诊断方法有限，也缺乏快速敏感的实验室技术，为结核病的早期诊断与治疗带来困难。酶联免疫斑点(Enzymelinkedimmu—nospotassay，ELISPOT)技术是一种新型的免疫酶技术，从单细胞水平检测分泌抗体细胞或分泌细胞因子细胞[2]。由ELISPOT发展而来的结核感染T细胞斑点试验(T-SPOT.TB)技术用于检测结核感染后特异性T细胞分泌的干扰素(IFN-γ)，并据此结果判断是否感染结核具有高度的敏感性和特异性,目前已广泛应用于临床诊断结核分支杆菌感染的相关疾病。本文就我院就诊的肺外结核病患者用T-SPOT．TB方法检测，探讨其对肺外结核快速诊断的应用价值。

1材料和方法

1.1对象收集

选自2012年6月至2013年2月于郑州市第六人民医院就诊的30名健康体检者，年龄18～50岁。30例非结核疾病患者，其中，6例肺癌，10例肺气肿，10例糖尿病，4例关节脓肿。以上病例均结合相关辅助检查，临床确诊排除结核感染。肺外结核患者45例，年龄18～72岁，所有患者均经病理检测或穿刺物查到抗酸杆菌确诊。其中淋巴结结核10例，骨结核5例，结核性腹膜炎10例，结核性胸膜炎17例，肾结核3例。所有检测均于早晨取血10m1。

1.2试剂和仪器

CO2细胞培养箱，结核杆菌感染T-SPOT．TB试剂盒。

1.3外周血单个核细胞的分离和计数

采集4ml外周血标本于8ml柠檬酸钠抗凝的真空采血管VacutainerCPT(BD)内，血标本注入管子后，立即轻轻颠倒5次，充分混匀血和抗凝剂。按试剂盒操作，制备细胞沉淀悬液。在1．5ml，离心管中加入10ul已制备样品细胞悬液和40ul的0．4％台酚兰(trypanblue)，制备l：5细胞稀释液。取10ul台酚兰／细胞混合悬液加入血细胞计数板并进行活细胞计数计算每毫升细胞数量。手工使用血细胞计数板，计数4×4大格含0.1ul样品。每毫升细胞数量=细胞计数×稀释倍数×104计算细胞稀释需要的体积并加入相应的AIM—V无血清培养液制备成终浓度为250000／100ul的稀释细胞工作液。

1.4检测

分别加人50ul培养基，阳性质控物，结核分枝杆菌特异抗原A和B于相对应阴性对照和阳性对照孔，A和B检测孔。对于每个标本加入100ul浓度为250000／100ul的稀释细胞工作液。37℃5％C02孵育16～20hrs。PBS洗板4次。加入50ulBCIP／NBT底物溶液至所有孔中。室温孵育7min。用去离子水充分洗涤孔的内部终止反应，在37℃2-3h或室温过夜干燥培养板。使用德国AIDread酶联斑点计数仪计数每个孔中的有色斑点。

1.5结果判断

阴性对照孔斑点数为0-5，阳性样本应为：(抗原A或抗原B斑点数)一阴性对照孔斑点数≥6点；或阴性对照孔斑点数≥6点，阳性样本应为：(抗原A或抗原B斑点数)≥2×(阴性对照孔斑点数)。如果阳性对照孔结果良好，但抗原A或抗原B均达不到阳性样本判断标准，则结果为阴性。

1.6统计学分析

检验结果均用阳性表示，采用卡方检验方法，应用SPSS13.0软件进行分析。

2结果

结核分枝杆菌抗原特异T细胞反应频率比较见下表。

表结核分枝杆菌抗原特异T细胞反应频率比较

结核分枝杆菌特异性T细胞阳性率在正常健康对照组和非结核疾病组间的差异无显著意义(P>0.05)，而结核病组均高于前两组(P<0.05)，45例结核病患者中结核抗原特异细胞阳性率68.9％，另两组分别为3.3％和0。而非结核病组和肺外结核组PPD阳性率比较差异无显著意义(P>0.05)，说明PPD在肺外结核诊断中价值不大。

3讨论

T-SPOT.TB技术是利用结核杆菌感染者外周血单核细胞(PBMC)中存在结核特异性T细胞，这些淋巴细胞在受到结核杆菌特异抗原刺激后分泌IFN-γ而设计的T细胞免疫斑点试验。PBMC、结核特异的混合抗原A和混合抗原B(分别为ESAT-6和CFP10的部分多肽片段)，与对照试剂一起加入预先包被抗抗体的微孔培养板进行培养。当PBMC中存在特异性T细胞时，培养液中加入的结核杆菌特异混合抗原多肽A和B将刺激其分泌。分泌的被微孔板上的抗IFN-γ捕获，再次加入的碱性磷酸酶标记并针对不同表位的抗体与被捕获的结合，滞留在微孔板表面，显色底物溶液在反应部位被酶分解形成不溶性色素沉淀斑点。每1个斑点代表1个IFN-γ型分泌细胞(结核特异的效应T细胞)。根据斑点数可以推测体内是否存在对结核杆菌反应的效应T细胞，而对结核杆菌感染进行辅助诊断。

本组资料中结核分枝杆菌特异性T细胞阳性率在正常健康对照组和非结核疾病组间的差异无显著意义(P>0.05)，肺外结核组与两对照组比较，差异均有显著差异(P<0．05)，T-SPOT．TB检测结核特异T细胞方法的敏感性为68.9％特异性84％。

另有资料表明T-SPOT．TB在普通人群中的敏感性为96％，在健康人群中的特异性为100％，在HIV阳性患者中的特异性为92％[3]。目前该技术已在国外广泛用于活动性结核病和结核潜伏感染者的诊断及HIV合并结核感染的检测[4]，用于区别结核感染与BCG接种以及耐药结核杆菌感染的快速检验。

目前，临床诊断结核的方法有限，细菌学是诊断结核的“金标准”，但结核菌培养需要2个月时间，快速培养也需要2周，而且阳性率取决于采集标本中细菌的数量等诸多因素，不利于早期诊断与治疗。影像学诊断对肺外结核诊断缺乏特异性，结核菌素试验(PPD)虽然操作简单，观察结果方便，但由于其假阳性和假阴性率较高，对临床结核病的诊断意义不大。

综上所述，T-SPOT．TB法作为一种新的酶免疫检测方法，具有敏感性高，特异性强，操作简单，需时少(一般48h出报告)等特点，有利于疾病的早期诊断与治疗，尤其在临床症状不典型、涂片及培养均为阴性的诊断不明确的疑似结核病患者，辅以T-SPOT．TB检测方法，可以帮助确诊结核感染。

参考文献

[1]全国第五次结核病流行病学抽样调查技术指导组.2010年全国第五次结核病流行病学抽样调查报告.中国防痨杂志,2012,34：485-508.

[2]侯世芳，许贤豪，刘广志，等．酶联免疫斑点(ELLS-POT)技术的应用[J1．中国神经免疫学和神经病学杂志，2002，10：200-202．

[3]ChapmanAL，MunkanmM，WilkinsonKA，etaLRapiddetectionofactiveandlatenttubereulosisinfectioninHⅣpositiveinpidualsbyenumerationofMycobate-riumtuberculosis--specificTcells[J]．AIDS，2002，16：2285-2293．

[4]刘国威,梅早仙.γ-干扰素释放试验在肺外结核病诊断中的临床意义[J].吉林医学,2012,(10):2056-2058.