简介:目的:通过弱化筛选基因二氢叶酸还原酶基因(dhfr),构建双顺反子全抗体表达载体,实现全抗体在CHO细胞中的高效表达。方法:将dhfr基因分为分别编码1-105和106~187氨基酸残基的2部分,分别通过linker与亮氨酸拉链GCN4融合,分别通过内部起始位点序列与抗体轻重链基因偶联,构建成2个双顺反子表达载体pIRESLZdhfr—H和pIRESLZdhfrL。用脂质体2000转染CHO-dhfr-细胞,用无次黄嘌呤和胸腺嘧啶脱氧核苷的IMDM筛选培养基筛选阳性克隆。结果:筛选到的阳性克隆表达水平为1.47-3.5μg/(106细胞·d),经氨甲蝶呤(MTX)梯度加压,在MTX浓度为5×10^-8mol/L时,表达水平达到11.5μg/(10^6细胞·d)。结论:构建了基于亮氨酸拉链二聚化基础的dhfr弱化方式的双顺反子表达载体,实现了全抗体在CHO—dhfr-细胞中的高效表达。
简介:目的:利用Mini—Tn5转座系统在葡糖杆菌中表达山梨糖脱氢酶(SDH)。方法:分离得到从山梨醇产糖的快生型小菌Y25K2,利用PCR方法扩增并分析快生型小菌的16SrDNA;构建pUT-mini—Tn5-Tet转座载体,将SDH基因(sdh)插入该载体,利用接合转移,将sdh整合至快生型小菌Y25K2的染色体,通过Western印迹检测SDH的表达。结果:16SrDNA鉴定结果初步表明快生型小菌为葡糖杆菌;构建得到pUT-mini—Tn5-Tet-sdh,将sdh整合至快生型菌Y25K2基因组,并检测到其在快生型小菌Y25K2中的表达。结论:利用Mini—Tn5转座系统在葡糖杆菌中表达了山梨糖脱氢酶。
简介:目的:构建真核表达质粒pEGFP-N1-mpafp698,转染人胚肾293T细胞,并表达准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白MpAFP698。方法:PCR扩增出mpafp698序列,将其克隆入本室保存的真核表达载体pEGFP-N1中,转染293T细胞;利用RT-PCR、流式细胞仪、免疫荧光、Western印迹检测蛋白表达。结果:构建了真核表达载体pEGFP-N1-mpafp698,在转染后24h可检测到绿色荧光的表达,而对照组则没有检测到荧光蛋白;Western印迹结果显示表达蛋白的相对分子质量约37000。结论:为准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白的细胞表达及功能研究奠定了基础。
简介:目的:研究胰岛素样生长因子ⅡmRNA结合蛋白Ⅲ(IMP-3)在不同病变子宫内膜组织中的表达,探讨其在子宫内膜病变发生过程中的作用机制。方法:应用免疫组织化学链霉菌抗生物素蛋白一过氧化酶连接法(SP法)检测20例正常子宫内膜组织、10例不典型增生内膜组织及40例子宫内样腺癌组织中IMP-3的表达情况,分析其表达量与子宫内膜癌临床病例特征之间的关系。结果:IMP-3在正常子宫内膜组织、不典型增生内膜组织及子宫内样腺癌组织中的相对表达量分别为5.361±1.074、13.587±2.301和19.572±1.936,两两间表达差异有统计学意义(P〈0.05);在不同手术-临床分期和病理组织学分级的子宫内膜癌组织中,IMP-3的表达量有统计学差异(P〈0.05)。结论:IMP-3可能参与调节子宫内膜病变的发生发展过程。
简介:目的:获得齐口裂腹鱼过氧化物酶体增殖物激活受体Y辅助活化因子1a(PGC-1a)cDNA序列,探讨其在齐口裂腹鱼肌肉组织中的表达规律。方法:根据斑马鱼基因PGC-1a序列设计引物,提取齐口裂腹鱼肌肉组织总RNA,经RT-PCR扩增PGC-1a仪基因序列;利用半定量RT-PCR分析齐口裂腹鱼PGC-1a基因在红肌和白肌中的mRNA表达特性。结果:获得齐口裂腹鱼PGC-1a基因序列2633bp,GenBank登陆号为JNl95738,其中ORF为2631bp,编码876个氨基酸残基,与同鲤科的斑马鱼、草鱼和金鱼的同源性较高,为88%~93%,但与哺乳动物和禽类如人、小鼠、大鼠、猪、牛和鸡的同源性较低,为49%~50%。在基础状态下,PGC-1a在齐口裂腹鱼红肌中的表达显著高于白肌,禁食可显著诱导PGC-1a在红肌和白肌中的表达水平。结论-首次克隆得到齐口裂腹鱼PGC-1a基因序列,其在红肌中的表达显著高于白肌中,禁食可显著诱导其在红肌和白肌中的表达,为研究PGC-1a在齐口裂腹鱼肌肉中的作用提供了理论依据。
简介:目的:探讨足月妊娠应用普贝生引产的临床疗效以及不良反应.方法:选取我院2014年2月到11月中80例足月妊娠有引产特征的孕妇,分为试验组和对照组,每组各40例,试验组给予普贝生引产,对照组给予缩宫素,观察两组的临床效果以及发生的不良反应.结果:试验组的有效率为95.0%明显的高于对照组的有效率70.0%,两组有效率之间的差异具有明显的统计学意义(P〈0.05),试验组的显效率为77.5%明显的高于对照组的37.5%,两组有效率之间的差异具有显著的统计学意义(P〈0.05);结论:足月妊娠应用普贝生引产的临床效果好,可以降低剖宫产率,而且安全性好值得临床上推广.
简介:以绿色荧光蛋白(GFP)基因作为报告基因,通过对比小鼠白蛋白启动子在不同来源细胞系中启动_GFP基因的转录活性,对小鼠白蛋白启动子的组织特异性进行了研究.结果发现,小鼠白蛋白启动子在小鼠肝癌细胞系Hepa1-6和人肝癌细胞系HepG2均有很强的转录起始功能,荧光显微镜下可以观察到GFP表达.Hepa1-6细胞在转染早期的48h内,CMV的启动子和增强子序列是小鼠白蛋白启动子转录活性的4倍.G418加压筛选2周后,CMV的启动子的转录活性下降到只有小鼠白蛋白启动子活性的1/2.转染入肝癌细胞系HepG22周后,荧光显微镜下可以观察到GFP表达.其他的细胞如中华仓鼠卵巢细胞系CHO和人肺癌细胞系PLA801中转染的小鼠白蛋白启动子不能启动GFP的表达,而对照CMV启动子控制下的GFP基因可在CHO和PLA801中表达.以上结果说明,小鼠白蛋白启动子仅在肝脏来源的细胞中可以起始下游基因的转录,在其他组织来源的细胞中不能起始转录,这表明小鼠白蛋白启动子具有肝脏组织特异的转录活性,但没有种属特异性.
简介:目的:应用重组杆状病毒表达系统制备由HA、NA、M1和M2蛋白组成的H5N1高致病性禽流感病毒样颗粒,为研究H5N1高致病性禽流感疫苗奠定基础。方法:构建能共表达A/chicken/Jilin/2003(H5N1)禽流感病毒血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)、A/PR/8/34(H1N1)流感病毒基质蛋白(M1)和离子通道蛋白(M2)的2个二元重组杆状病毒,共同感染HighFive细胞,同时表达HA、NA、M1和M2蛋白,使这4种蛋白在感染的细胞内自主组装成病毒样颗粒。经差速离心和蔗糖密度梯度超速离心收获病毒样颗粒,通过Western印迹鉴定病毒样颗粒的组成,透射电镜观察病毒样颗粒形态,血凝试验测定病毒样颗粒的活性。结果:HA、NA、M1、M2蛋白在昆虫细胞中共表达,并组装成病毒样颗粒;电镜观察到病毒样颗粒的形态与流感病毒一致,直径约80nm;血凝试验显示该病毒样颗粒具有凝集鸡红细胞的活性。结论:应用该方法可以制备流感病毒样颗粒,为H5N1流感疫苗研究提供了可行方案。
简介:目的:融合表达结核分枝杆菌Rv3881c突变子抗原,以便与其他已知的免疫显性抗原联合使用,有效增加结核分枝杆菌感染血清学检验的敏感性和特异性。方法:将克隆的来源干结核分枝杆菌H37Rv株的Rv3881c突变体基因插入原核表达载体pET24b,并在大肠杆菌BL21中获得高效表达;由于重组的Rv3881c突变子抗原片段同C端的6xHis标签融合表达,使用Ni-柱进行快速纯化。结果:Western印迹表明,重组的Rv3881c突变子抗原同选取的6例结核病阳性临床血清标本均能发生明显的反应。结论:重组Rv3881c突变体具有较好的特异性,提示该抗原可能成为检测结核的有效抗原之一。