简介:摘要目的观察布鲁菌外膜蛋白(OMP)16脂化型(L16)和非脂化型(U16)对成骨细胞的毒力效应。方法利用大肠埃希菌BL21(DE3)原核表达系统制备L16和U16重组蛋白,并使用镍柱纯化。采用成组设计,利用小鼠成骨细胞系(MC3T3细胞)分别与L16和U16重组蛋白共孵育(L16、U16刺激组),以布鲁菌脂多糖(LPS)刺激物为阳性对照(LPS对照组),未加任何刺激的细胞作为阴性对照,孵育时间为24 h。CCK-8法检测MC3T3细胞的活力;离心收集培养细胞上清,生物发光法测定上清中乳酸脱氢酶(LDH)的释放率,评价L16和U16对MC3T3细胞的毒力作用;进一步使用Annexin Ⅴ-PE/7-AAD双染流式细胞术检测MC3T3细胞的凋亡率,以及通过免疫印迹法(WB)检测凋亡执行蛋白Caspase-3的活化水平。结果L16刺激组细胞活力[(56.16±1.63)%]显著低于U16刺激组和LPS对照组[(97.02±1.44)%、(98.64±0.90)%,P均< 0.01],LDH释放率[(84.64±0.96)%]显著高于U16刺激组和LPS对照组[(34.82±3.41)%、(26.75±1.95)%,P均< 0.01]。Annexin Ⅴ-PE/7-AAD染色结果显示,L16刺激组细胞凋亡率为(46.45±2.19)%,而其余组均< 1%。WB结果显示,L16刺激组细胞内存在活化的Caspase-3,而U16刺激组和LPS对照组未检测到此活化片段。结论L16能诱导成骨细胞的凋亡,使成骨细胞的增殖受到抑制,而U16的作用不明显,具备完整脂化结构的布鲁菌L16是毒力效应所必需的。
简介:摘要目的分析高压氧对脑梗塞急性期血小板a颗粒膜蛋白的含量影响变化。方法本院所探究的100例病高压氧对脑梗塞急性期患者,是用定量测定法、双夹心放免测定法来测定两组脑梗塞急性期病人100例,并将这两组患者随机均分为高压氧组和对照组,各50例。检查两组患者在治疗前后20天以内的血小板α颗粒膜蛋白含量。结果脑梗塞急性期患者在治疗前后的血小板α颗粒膜蛋白含量较正常值明显增高,具有显著性差异。高压氧组和对照组血小板α颗粒膜蛋白含量明显下降,两组的差异显著,具有统计学意义(P<0.05)。结论脑梗塞急性患者在进行常规用药时,常规用药结合高压氧治疗可有效降低血小板活性。
简介:本文利用单位点免疫放射结合试验来比较抗人血小板α-颗粒膜蛋白(GMP-140)、溶酶体膜蛋白(LIMP-CD63)、溶酶体膜相关蛋白(Lamp-1,Lamp-2)的单抗在检测血小板活化程度方面的应用价值。血小板表面GMP-140的分子数在被检的冠心病、急性心肌梗塞、风湿性心脏病及肺原性心脏病中均呈显著升高(P<0.01);LIMP-CD63分子数仅在冠心病及肺心病中呈显著升高(P<0.05);Lamp-1分子数仅在肺心病中呈显著升高;而Lamp-2分子数均未见显著改变。结果提示4种抗血小板活化标志蛋白的单抗中,GMP-140的单抗可作为疾病状态下判断体内血小板活化程度的指标,LIMP-CD63次之,而Lamp的单抗在疾病中应用价值不大。
简介:摘要目的从中国人类免疫缺陷病毒I型(human immunodeficiency virus type I, HIV-1)慢性感染者体内筛选针对膜蛋白的单克隆抗体并对其进行功能鉴定。方法采用单细胞特异性分选的方法从HIV-1感染者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)中筛选抗原特异性单个B细胞,通过逆转录和巢式PCR获得抗体重链和轻链的可变区基因。利用免疫遗传学数据库(immunogenetics database, IMGT)分析抗体基因家系及突变率。抗体表达纯化后,采用酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)鉴定其结合活性和识别表位,通过假病毒中和实验检测抗体中和能力。结果从1例慢性HIV-1感染者样本中筛选得到7个HIV-1膜蛋白特异性抗体。抗体重链可变区基因来自IGHV1-69*09、IGHV1-08*01、IGHV1-46*01、IGHV4-34*01、IGHV4-61*01和IGHV3-43*02家系,突变率为10.76%~21.05%。轻链可变区基因来自IGKV3-20*01、IGKV1-39*01、IGKV1-NL1*01、IGKV3-15*01和IGKV1-9*01家系,突变率为6.03%~18.64%。7个抗体均可以结合gp140,其中抗体508-B1、508-C1、508-C5、508-D4和508-E5主要识别gp41区;508-D6和508-F1结合gp120区。508-D4和508-F1分别可以中和Global Panel假病毒盘中的CNE8(Tier 2)和X2278(Tier 2),IC50值分别为38.1 μg/ml和41.7 μg/ml。结论本研究成功筛选得到7个HIV-1膜蛋白特异性的单克隆抗体,其中5个为识别gp41区的单克隆抗体,2个为gp120结合抗体。2个抗体具备有限的中和能力。该组抗体可为HIV-1检测试剂和抗体药物研发以及艾滋病疫苗免疫原设计提供技术储备。
简介:目的:应用蛋白质组学技术研究幽门螺杆菌(HP)的候选抗原,用于胃部疾病临床诊断、治疗和疫苗开发.方法:选择自胃腺癌患者胃粘膜分离出且经确定的HP菌株(HP161),采用二维凝胶电泳(2-DE)分析外膜蛋白,并通过PDQuest图像分析软件分析蛋白质图谱,进行蛋白斑点检测和分析;收集20例HP感染患者和10例非HP感染相关性胃炎患者血清,采用免疫印迹技术分析HP161的外膜蛋白质与上述血清的反应性.结果:HP161有129个蛋白斑点;被慢性活动性胃炎和胃癌患者血清不同识别的特定抗原有10个;应用胃癌患者血清时,具有免疫反应性,而用胃炎患者血清时则无,等电点范围较宽,分子量多数在31kDa以下.结论:2-DE是研究HP外膜蛋白质组学的重要途径之一,并可能对其进行鉴定作为临床诊断的候选分子;经免疫蛋白组学检测的资料与公共数据库进行对比分析,以有助于寻找更具免疫原性的蛋白质标记物用于诊断分析和疫苗设计.
简介:摘要目的观察囊泡相关膜蛋白5(VAMP5)在三阴性乳腺癌(TNBC)组织的表达,探讨其与TNBC临床病理特征及患者预后的关系。方法收集2013年至2015年新疆医科大学附属肿瘤医院TNBC患者组织标本145例,采用免疫组织化学法检测VAMP5表达水平,采用实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)检测VAMP5在MDA-MB-231细胞和MCF-10A细胞中的表达,应用SPSS 25.0统计软件分析VAMP5表达状态与TNBC患者临床病理参数的关系,用Kaplan-Meier法进行生存分析。结果与正常乳腺细胞株比较,TNBC细胞株VAMP5表达水平明显降低,差异有统计学意义(t=4.261,P<0.01)。TNBC组织中VAMP5的高表达率为35.9%(52/145),低于癌旁组织100.0%(15/15),差异有统计学意义(P<0.01)。VAMP5的表达与肿瘤大小、临床分期、淋巴结转移、组织学分级、细胞核增殖抗原(Ki-67)明显相关(χ2=14.011、12.874、5.607、4.614、5.633,P<0.05),差异有统计学意义。Kaplan-Meier生存分析结果显示,VAMP5高表达组与低表达组总生存期差异无统计学意义(χ2=0.143,P>0.05)。结论VAMP5在TNBC组织中低表达,与TNBC恶性程度呈负相关。
简介:摘要目的探讨针对糖尿病高凝状态患者,观察自身血小板α颗粒膜蛋白(GMP-140)、纤维蛋白原(Fg)以及D-二聚体(D-D)的临床检测结果。方法选取我院2012年12月—2014年12月糖尿病患者138例。根据患者出现血管并发症的情况分为A1组(血管并发症70例)以及A2组(无血管并发症68例)。同期选择健康人员60例作为A3组(对照组)。针对所有研究对象的血浆GMP-140水平、Fg水平以及D-D水平进行测定。结果在血浆GMP-140水平、Fg水平以及D-D水平等方面,A1组以及A2组明显高于A3组研究对象(P<0.05);并且A1组明显高于A2组患者(P<0.05)。结论针对糖尿病患者,其自身血液处于高凝状态,患者的血小板功能出现了异常情况,并且往往表现出继发性纤溶亢进的情况。对患者的血浆GMP-140水平、Fg水平以及D-D水平进行测定,针对患者的血栓前状态以及患者出现血管病变的情况可以进行有效明确,最终研究有效方法进行干预治疗。
简介:目的评价嗜肺巴氏杆菌外膜蛋白(OMP)和脂多糖(LPs)作为血清学诊断抗原的敏感性和特异性.方法用OMP、LPS和全菌(WC)作为Westernblot和ELISA的诊断抗原检测自然感染和实验感染嗜肺巴氏杆菌小鼠相应的IgG抗体滴度,同时测定3种抗原与实验动物常见致病菌的交叉反应.结果与嗜肺巴氏杆菌自然感染和实验感染小鼠血清的ELISA反应中,不同时期,LPS作为诊断抗原时血清抗体阳性率最高,WC次之,OMP最低.自然感染小鼠群中,出生4周LPS抗体阳性率即可达80%,而同期的WC和OMP仅为25%和20%,故LPS敏感性最高.与实验动物常见致病菌免疫血清和阴性种鼠血清的ELISA反应中,WC抗原表现出较高的吸光度(A)值,经Westernblot证实,其反应为非特异性反应,LPS抗原特异性最强,OMP抗原次之.结论混合多株具有型或种特异性的OMP或LPS作为ELISA的诊断抗原,无论从特异性和敏感性上均高于全菌抗原.
简介:目的:筛选1型人免疫缺陷病毒(HIV-1)中国流行株中包膜蛋白gp41的优势抗原片段,构建具有区域流行代表性的HIV-1gp41重组抗原,为改进现有HIV-1初筛试剂盒中使用的同类抗原奠定基础。方法:利用免疫斑点杂交和生物信息学方法,从收集自重庆、广州、上海的区域代表性150份HIV-1感染者血清标本中筛选gp41抗原性强的候选样本,利用RT-PCR及巢式PCR方法扩增包含重要抗原表位决定蔟的gp41基因片段,与原核表达载体pQE30连接,转化大肠杆菌M15构建gp41重组抗原表达菌株,表达后经亲和层析纯化、SDS-PAGE和Western印迹鉴定。结果:兔源HRP标记的gp41多抗能识别标本中gp41抗原性差异,得到候选样本,扩增包含gp41主要抗原表位片段;构建了包含gp41抗原表达簇的重组原核表达质粒,表达、纯化后经His标签抗体Western印迹鉴定为阳性。结论:高纯度的重组优势gp41抗原的构建和鉴定,为进一步改进现有HIV初筛诊断奠定了基础。