简介：目的筛选一种既提高精子转染外源DNA效率，又保持解冻后精子活力的山羊精液冷冻—解冻方法。方法应用正交设计L9（3^4），因素分别为稀释液种类、稀释比例、降温时间和解冻液，每个因素选择3个水平，检测和比较解冻后精子转染外源DNA效率和精子活力。结果所选冷冻—解冻各因素对精液转染效率影响不显著[F（8，18）=1．032，P=0．449]；平衡时间对冷冻—解冻活力影响极显著[F（2，24）=9．972，P=0．001]，平衡1h极显著小于平衡2h和4h的精液活力（P=0．003，P=0．000），以平衡4h最好。用筛选的冷冻—解冻方法处理精液，解冻后精子的活力极明显降低（P=0．002）；生存指数降低，GOT释放量增加，菌落数减少，与鲜精相比差异显著（P=0．018；P=0．016；P=0．018）；精子畸形率增加，顶体完整率降低，与鲜精相比差异不显著（P=0．494；P=0．084）。结论优化了提高精子转染外源DNA效率的山羊精液冷冻—解冻方法。

简介：将壳聚糖纳米粒包裹的报告基因pEGFP-N1质粒转染至HEK293细胞,并在HEK293细胞中成功表达荧光蛋白的基础上,进一步将本室自行构建的PNP基因的真核高效表达载体质粒pcDNA3-PNP转染至HEK293细胞.转染72h后,对转染的HEK293细胞给予前体药6-MPDR至终浓度40μg/ml,一天后,采用MTT比色法测定药物对细胞增值的影响,并进行统计学处理.实验结果表明采用壳聚糖纳米粒转染试剂转染并给予前体药6-MPDR的实验组活细胞数,与用壳聚糖转染但不给前体药6-MPDR的对照组活细胞数相比,有显著差异(P＜0.05),说明新筛选出的壳聚糖纳米粒转染试剂可以将PNP自杀基因递送至靶细胞中,并在细胞中进行表达,从而使PNP/6-MPDR自杀基因系统发挥杀伤细胞的作用.分别采用相同工作浓度的脂质体与壳聚糖纳米粒转染试剂转染相同浓度的基因质粒,壳聚糖纳米粒对靶细胞生长数量影响很小,说明的壳聚糖纳米粒细胞毒性大大低于阳离子脂质体的细胞毒性.

简介：造血干细胞因其具有自我更新和多向分化能力而成为基因治疗的理想靶细胞，但由于逆转录病毒介导的造血干细胞基因转染效率低，外源基因表达时间短等，大大影响了造血干细胞基因治疗的临床应用。为克服上速难点，目前的研究策略主要集中在构建新型理想的逆转录病毒载体及从不同的方面优化转染体系，从而提高基因转染效率。

简介：目的建立正常（CAG重复次数为19次）和异常（CAG重复次数为82和66次）atrophin-1[齿状核红核苍白球路易体萎缩（DRPLA）致病基因]全长基因真核表达体系，通过观察细胞形态及蛋白质表达水平和分布情况，比较稳定转染和瞬时转染两种细胞表达体系，为进一步研究建立良好的细胞模型。方法基于已构建的GFP-atrophin-1．019／Flp—InTREx293和GFP—atrophin-1-Q82／Flp—InTREx293两种稳定转染细胞株，利用四环素调控系统Tet—on诱导表达。正置荧光显微镜观察正常与异常atrophin-1融合蛋白在细胞中的表达定位，电子显微镜观察细胞超微结构的改变；脂质体介导法将重组真核表达质粒GFP—atrophin-1-Q19和GFP—atrophin-1-Q66瞬时转染293T和SH—SY5Y细胞，HE染色、倒置荧光显微镜和电子显微镜分别观察细胞形态结构、蛋白质表达定位和细胞超微结构，Westernblotting检测atrophin-1融合蛋白表达水平。结果在稳定转染体系中，绿色荧光信号大多位于细胞核内，异常蛋白质呈不均匀分布且有少数聚集现象；电子显微镜观察异常细胞胞核结构欠完整，核膜皱缩，核内结构紊乱。在瞬时转染293T细胞体系中，HE染色可见异常细胞核内形成粉紫色嗜酸性小体；大量atrophin-1融合蛋白在核内呈点状聚集现象；电子显微镜观察异常细胞核膜皱缩严重，核内大量电子致密物沉积且核仁消失；Westernblotting检测均表达atrophin-1融合蛋白。在转染的SH-SY5Y细胞体系中，蛋白质表达定位及Westernbloning检测结果与转染293T细胞基本一致。结论包含异常扩增多聚谷氨酰胺链的atrophin-1融合蛋白在真核表达体系中可产生明显的核内聚集现象，并引起细胞形态改变，此为研究DRPLA核内包涵体的形成及其在发病中的作用，以及进一步的干预治疗奠定了理论基础。

简介：微小RNA（MicroRNAs,miRNAs）是一种内源性非编码RNA,主要参与基因转录后水平的调控。虽然miRNA的生物学功能刚刚被人们熟知,它在疾病的发病和进展中所显现的治疗潜力已引起人们极大的兴趣。越来越多的证据表明,以miRNA为基础的基因治疗,不管是增强或抑制miRNA的表达和活性,都有很大的应用前景。但是靶向特定器官和组织特异性差的缺点,使得其应用于临床还存在限制。

简介：本文介绍了阳离子脂质体、聚合胺、减毒侵袭性细菌、Cochleates等可介导疫苗DNA转染的载体，并对肌肉注射、基因枪导入、皮内皮下注射及粘膜接种等可用以DNA疫苗接种的几种免疫途径作一简述。

简介：本研究比较AD5/F35腺病毒载体对不同来源的血液系统恶性细胞系感染效率的差异和细胞毒性反应.用AD5/F35-EGFP以不同MOI（感染复数）感染不同来源的血液恶性细胞系并用AD5-EGFP作为对照;用流式细胞术检测荧光阳性细胞比例,进行荧光显微镜照相并用MTT法检测病毒对感染靶细胞的杀伤作用.结果表明：对于髓系来源的细胞在MOI为30时,AD5/F35载体的感染效率大于99%,AD5载体在MOI为1000时感染效率为26.4%;对于B系来源的细胞在MOI为1000时,AD5/F35载体感染效率为11.7%,AD5载体为5.7%;AD5/F35和AD5载体都不能有效地感染T系来源细胞,在MOI达到1000也未检测到荧光阳性细胞.在MOI为1000的情况下AD5/F35载体对感染靶细胞也无明显杀伤作用.结论：AD5/F35载体对不同来源的血液恶性细胞的感染具有一定的选择性,对髓系来源细胞感染能力强,对B系来源细胞有一定感染能力,而且对感染靶细胞毒性小.AD5/F35载体优于常用的5型腺病毒载体,在以髓系细胞为靶细胞的基因治疗中有着较好的应用前景.

简介：上海交通大学肿瘤研究所等单位的科研人员经过多年攻关，创建了大规模细胞DNA转染技术平台，通过该平台可直接筛出具有影响细胞生长、肿瘤发生发展相关基因，具有重要的潜在的应用与开发价值。该研究日前获得2004年上海市科技进步一等奖。

简介：目的比较腺病毒、脂质体、纳米材料三种不同类型的载体携带目的基因对293T细胞的转染效率及细胞毒性的大小,筛选理想的基因载体。方法用重组腺病毒、Lipofectamine^TM2000、Entranster^TM—D纳米材料为转染载体,携带含有增强型绿色荧光蛋白（EGFP）报告基因的Math1-EGFP基因及真核表达质粒pRK5-Math1—EGFP，按照转染试剂盒说明优化其转染条件，分别转染293T细胞。24小时后在共聚焦显微镜下观察转染结果并计数阳性细胞率，采用RT—PCR法检测转染细胞中Math1基因mRNA的表达，用MTT法检测不同转染条件下，不同转染载体对293T细胞的细胞毒性。结果经优化转染条件，重组腺病毒载体转导的细胞中荧光蛋白表达几乎为95％以上,Lipofectamine^TM2000、Entranste^TM-D纳米材料载体转染的细胞中荧光蛋白表达也分别达到70％和80％以上，而Entranste^rTM-D纳米材料载体在最高转染效率的剂量下仍然保持80％以上的细胞生存率。RT-PCR进一步证实，三种载体转染细胞均有Math1基因mRNA的表达。结论Entranster^TM—D纳米载体作为一种新型纳米聚合物转染试剂，能成功携带内耳基因治疗关键基因Math1基因转染293T细胞，并表现了低毒、高效性能。

简介：心力衰竭是各种心血管疾病的终末阶段,至今死亡率仍居高不下.近年来心力衰竭的基因治疗取得了很大的进步,有望成为心力衰竭新的治疗途径.然而,潜在治疗靶基因的选择、向大动物模型的过渡以及提高病毒转染技术的效率仍是目前难以克服的困难.本文仅就目前体内心肌基因转染技术的进展作一综述.

简介：对原代人体嗜中性粒细胞的转染是很重要的,因为它实现了对人体发炎响应中通道的研究,而这在以前是很难实现的,原因在于培养嗜中性粒细胞很困难。通过这项研究,从细胞存活率及siRNA传递角度,研究者确立了最佳的嗜中性粒细胞转染的电穿孔条件。使用这些条件,可以进一步将该技术应用到包括干细胞在内的其他难以转染的原代细胞中。可以预见,这一领域将会在不久的将来蓬勃发展起来。

简介：目的:悬浮细胞的转染较贴壁细胞存在一定难度,用多聚赖氨酸包被的细胞培养板培养悬浮细胞使其贴壁,用脂质体2000按照贴壁细胞转染的方法转染悬浮细胞,提供一种高效的转染悬浮细胞的方法。方法:悬浮细胞Jurkat或CCRF-CEM培养于包被了0.1mg/mL多聚赖氨酸的细胞培养板,16h后洗掉未贴壁的细胞,用脂质体2000分别将pWPXLd质粒或靶向人ABL1基因的小干扰RNA(siRNA)转染细胞,24h后于荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达,鉴定质粒的转染效率,或用Western印迹鉴定siRNA的干扰效率。结果:pWPXLd成功转染2种细胞,siRNA成功抑制了ABL1的表达。结论:质粒和siRNA均能成功转染,提供了一种高效可行的转染悬浮细胞的方法。

简介：目的探讨下丘脑过度兴奋对于颞叶癫痫行为学变化的影响,从而进一步阐明下丘脑与颞叶癫痫的关系以及谷氨酸受体2亚基Q型(glutamatereceptor2Q,GluR2Q)在癫痫发病中的作用机制.方法20只Wistar大鼠随机分为海人酸(kainicacidorkainite,KA)组(KA对照组)与KA+GluR2Q组,分别观察两组大鼠的癫痫行为.结果KA对照组大鼠癫痫发作程度较轻,主要以部分性发作为主且发作次数少,持续时间短,较少出现全面性发作.KA+GluR2Q组大鼠癫痫发作程度剧烈,部分性癫痫发作较KA对照组更早、更频繁且由部分性发作转化为全面性发作的比率高于KA对照组.结论通过HVJ-脂质体基因转染技术将GluR2Q基因转染到下丘脑乳头体可以提高其兴奋性,并使该兴奋性冲动通过下丘脑与海马之间的联络纤维传导至海马齿状回及CA3、CA1区,使海马区原有的兴奋性加强,表现为癫痫行为的加重,从而促进了癫痫的发展及传播.

简介：背景：对牙髓干细胞进行稳定高效安全的体外标记是示踪技术中首先需要解决的问题，也是牙齿再生体内研究的基础。目的：探讨慢病毒载体介导绿色荧光蛋白转染大鼠牙髓干细胞的理想条件及方法，并确定其转染后是否保持干细胞特性。方法：通过改良酶消化法获得大鼠牙髓干细胞，对其免疫表型及分化潜能进行鉴定，以感染复数为5，10，25，50和100的慢病毒载体介导绿色荧光蛋白作用24h和48h，倒置显微镜下检测转染率和荧光强度，并对大鼠牙髓干细胞感染前后的克隆增殖能力、细胞周期及牙向分化能力进行比较，评价感染对其生物学特性的影响。结果与结论：流式细胞仪检测结果显示大鼠牙髓干细胞STRO-1和CD146表达阳性，CD34和CD45表达阴性，经相应诱导培养后可向成骨和成脂分化。当感染复数为50，作用时间为48h时，转染效率最高，荧光表达最强；感染前后细胞增殖、克隆形成率及细胞周期等方面差异无显著性意义（P＞0.05），碱性磷酸酶阳性表达。说明感染复数为50作用48h是慢病毒载体介导绿色荧光蛋白转染大鼠牙髓干细胞的理想条件，且不影响牙髓干细胞生物学特性，为大鼠牙髓干细胞的体内研究提供了可靠的示踪方法。

简介：目的研究外源性干扰素-β(IFN-β)基因对胶质瘤细胞系SHG-44的诱导凋亡作用,探索胶质瘤基因治疗的新途径.方法利用脂质体转染方法将IFN-β真核表达载体pSV2IFNβ导入人SHG44胶质瘤细胞.应用流式细胞仪和免疫荧光法检测IFN-β基因的稳定转染及表达,利用Hoechst染色、透射电镜观察细胞凋亡情况.结果IFN-β基因成功转染SHG44胶质瘤细胞并得以表达,并诱导SHG44胶质瘤细胞凋亡.结论IFN-β能够诱导人SHG44胶质瘤细胞凋亡,本实验为IFN-β基因治疗人脑胶质瘤的应用奠定了初步基础.

简介：摘要目的探讨以慢病毒（Lentivirus,LV）为载体，转染绿色荧光蛋白（Greenfluorescenceprotein,GFP）基因至神经干细胞(Neuralstemcells,NSCs)的方法，观察其转染效率。方法应用包装细胞293T将三种质粒载体pGC-E1-GFP、pHelper1.0和pHelper2.0经脂质体转染重组，构建成表达GFP的慢病毒载体（Lentiviralvector-GFP,LV-GFP）。并从孕14天大鼠胚胎的脑组织分离出神经干细胞，采用无血清培养法，进行体外培养、扩增。取经过5次传代神经干细胞，以1×105个细胞/500μl/孔接种于24孔板，分别按复感染指数（Multiplicitiesofinfection,MOIs值）为0、1、5、10、15、20加入LV-GFP稀释液100μl,每一滴度加六孔,共六组。48～72小时后于倒置荧光显微镜下观察各组GFP的表达效率，并在72小时后进行神经干细胞球进行计数，以观LV-GFP对NSCs增殖的影响。并行流式细胞仪检测，得出各组NSCs的GFP阳性转染率。结果除MOI值为0的对照组外，48～72小时后各孔均有GFP表达。MOI值从0增至10，细胞的阳性表达率逐渐提高(P<0.05)，MOI值为10的组能获得>90%的转染率。但MOI值从10增至20，形成的神经干细胞球数目却逐渐减少(P<0.05)。结论LV是将目的基因转入NSCs的理想载体。以MOI为10的滴度，LV可将GFP基因高效转入神经干细胞内并表达。

简介：基因治疗疾病的有效性主要取决于基因转染率,基因转染载体包括病毒载体和非病毒载体。超声微泡造影剂为一种新型非病毒载体,介导基因转染具有安全、靶向、目的基因转染率高等优点,本文对近年来超声微泡造影剂介导基因转染的研究进展进行综述。

简介：目的探讨人心房肽(hANP)cDNA转染细胞的微囊化技术，测定其ANP的表达水平，以及研究ANP分泌的近日节律；通过人工调控，改变ANP分泌的近日节律，达到有效治疗高血压或心衰的目的。方法将人ANP基因(cDNA)转染入CHO细胞，然后将细胞包被在聚己内酯(PCL)管内形成微囊，并检测转基因CHO细胞长时间存活情况和分泌的ANP。检测微囊化转基因细胞分泌ANP的生物节律，并用褪黑素(melatonin)进行调整。结果在培养期间，长度20mm直径3mm的PCL管内转染CHO细胞在2ml培养基中24小时分泌的ANP水平可达210．3ng／L；ANP的分泌呈近日节律性变化，日间高，而夜间低；近日节律变化的时相是4：15，用melatonin处理，近日节律的时相移至7：55。结论ANPcDNA转染的CHO细胞包被在PCL管内并能向管外分泌ANP．将来可能话于植人人体．此项研奔为心房肽治疗高血压或心衰提供了一条新途径。

简介：摘要目的探讨带有增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因的pEGFP.N3是否能够有效转染ADSCs。方法提取pEGFP-Genesil-1质粒，采用Lipofectamine2000脂质体将绿色荧光表达质粒Genesil-1载体转染至ADSCs。镜检各个时间点含有荧光的鼻咽癌细胞数，并选取转染率最高时间点的鼻咽癌细胞，用流式检测精确的转染率。结果脂质体复合物转化ADSCs24h后，荧光倒置显微镜下可见绿色荧光，4ug/ml质粒浓度组转染48小时绿色荧光蛋白阳性细胞率达最高值。结论带有增强型绿色荧光蛋白基因的pEGFP.N3可以较为高效地转染ADSCs。

简介：摘要目的探讨聚凝胺对小鼠骨髓源树突状细胞(BMDCs)的毒性作用以及聚凝胺促慢病毒载体转染BMDCs的最佳浓度。方法制备BMDCs悬液，随机分为实验组和对照组。实验组用不同浓度的聚凝胺处理，对照组中加入等量磷酸盐缓冲液(PBS)，采用细胞计数试剂盒(CCK-8)法和膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)/碘化丙锭(PI)双标记法评价聚凝胺对BMDCs的毒性作用。向BMDCs悬液中加入慢病毒载体[感染复数(MOI)＝10]，实验组用不同浓度的聚凝胺处理，对照组加入等量PBS，每天采用荧光显微镜动态观察各组绿色荧光蛋白(GFP)表达。刺激BMDCs成熟后，采用流式细胞术定量检测GFP表达。各组之间两两比较采用独立样本t检验。结果聚凝胺浓度≥11 mg/L时，活细胞数目显著减少[吸光度(A)值(0.881±0.007)比(1.031±0.017)，t＝7.832，P<0.05]，差异有统计学意义。安全浓度范围内，使用聚凝胺能显著提高GFP表达，聚凝胺浓度为8 mg/L时，GFP表达最高。结论聚凝胺对BMDCs存在剂量依赖的毒性作用，安全浓度范围内，聚凝胺可明显提高慢病毒载体对BMDCs的转染率，最适浓度为8 mg/L。