简介:目的:构建EF-1α-Flag到pcDNA3.0表达载体上,在哺乳动物细胞中表达并纯化延伸因子1α(EF-1α),测定其对体外蛋白翻译的影响。方法:通过PCR技术从293T细胞cDNA文库中扩增EF-1α基因片段,连接到pcDNA3.0载体上,经电泳、测序和转入细胞中检测EF-1α-Flag蛋白表达等方式验证所构建的重组质粒是否正确,然后经Flag肽置换法纯化出EF-1α蛋白用于体外蛋白翻译实验,萤光素酶活性检测翻译出的蛋白含量。结果:测序和蛋白表达鉴定结果表明扩增的EF-1α-Flag基因序列正确,所构建的重组载体在哺乳动物细胞中能获得表达;考马斯亮蓝染色发现经Flag肽置换的EF-1α蛋白纯度较高,在体外蛋白翻译实验中EF-1α蛋白能促进蛋白的翻译。结论:从哺乳动物细胞中纯化的EF-1α蛋白能促进蛋白翻译,可能与其作为翻译延伸因子相关,为进一步研究EF-1α的功能奠定了基础。
简介:目的:SARA/SBD是纤维化形成过程中的负性调节因子。原核表达、纯化含反式激活蛋白(TAT)蛋白转导域(PTD)的TATPTD-SARA/SBD融合蛋白,并鉴定其生物学活性。方法:将TATPTD-SARA/SBD基因克隆入带His标签的原核表达载体pET-44a(+)中,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,表达产物经Ni2+-NTA亲和层析柱纯化后,SDS-PAGE和Western印迹鉴定目的蛋白;用人腹膜间皮细胞系(HPMC),通过免疫细胞化学方法检测其穿膜能力,及与TGF-β1信号通路中Smad2因子的共定位情况。结果:用基因工程方法表达和纯化了TATPTD-SARA/SBD融合蛋白,目的蛋白约占菌体总蛋白的20%左右,且以可溶形式表达,经Ni2+-NTA纯化后,所获蛋白纯度高于95%(HPLC归一法);功能学实验结果显示该蛋白能穿过胞膜,主要定位于胞核,且与Smad2因子具有核内共定位。结论:表达了TATPTD-SARA/SBD融合蛋白,该蛋白具有生物学活性。
简介:【目的】二化螟是水稻的重要害虫之一,钙黏蛋白(cadherin,CAD)是一类重要的Bt杀虫蛋白受体,在获得二化螟钙黏蛋白基因(CsCAD1)的基础上,明确CsCAD1蛋白与Cry1Ac和Cry2Aa蛋白的结合能力。【方法】利用PCR技术克隆CsCAD1基因片段,将构建的pET-28a-(+)-CsCAD1重组质粒转入原核表达菌株BL21(DE3)中,IPTG诱导表达。目的蛋白经Ni柱亲和纯化后SDS-PAGE电泳检测,利用westernblot和ligandblot技术分析其与Cry1Ac和Cry2Aa蛋白的结合能力。【结果】重组载体可在表达菌株BL21中表达一个约44ku的蛋白,原核表达载体构建成功。SDS-PAGE显示该蛋白条带单一,且纯度较好。Ni柱亲和层析纯化该目的蛋白后进行Ligandblot分析,结果显示CsCAD1重组蛋白可以与Cry1Ac和Cry2Aa蛋白结合。【结论】CsCAD1蛋白可以与Cry1Ac和Cry2Aa蛋白结合,是潜在的Cry蛋白受体,所得结果有助于阐明Cry1Ac和Cry2Aa蛋白对二化螟的作用机制。
简介:与许多在细胞浆内复制的RNA病毒不同,流感病毒的复制及转录都在细胞核内进行。流感病毒感染细胞进入细胞浆后,经病毒脱壳将病毒核糖核蛋白体复合物(vRNP)释放到细胞浆。vRNP含有病毒的RNA基因和碱性聚合酶1(PB1)、碱性聚合酶2(PB2)、酸性聚合酶(PA)及核蛋白(NP)。vRNP被主动运送到细胞核内,开始病毒基因组的复制和转录。流感病毒感染细胞的晚期,在细胞浆中新合成的PB1、PB2、PA及NP蛋白也需要进入细胞核,参与新的vRNP的装配。我们简要介绍有关流感病毒vRNP和新合成的PB1、PB2、PA及NP蛋白进入细胞核的机制。
简介:目的:研究西比灵对沙鼠脑缺血再灌注后核因子-κB、单核细胞趋化蛋白-1表达的影响。方法:52只健康蒙古沙鼠随机分为正常对照组、假手术组、脑缺血再灌注(I/R)组、西比灵干预组,I/R组及西比灵干预组再分为6h、1d、3d、7d四个亚组。通过夹闭双侧颈总动脉10min后松夹,建立沙鼠全脑缺血再灌注模型。采用免疫组化的实验方法检测各组脑组织中NF-κBp65、MCP-1的表达。结果:缺血再灌注后各时间点I/R组及西比灵干预组,NF-κBp65的表达量显著高于正常对照组及假手术组(均P〈0.01),且出现MCP-1阳性表达。与I/R组比较,西比灵干预组在I/R后6h、1d,NF-κBp65、MCP-1表达下调(均P〈0.05)。结论:在脑缺血再灌注早期,西比灵能够下调NF-κBp65、MCP-1的表达,减轻局部炎症反应及脑缺血再灌注损伤。
简介:目的:构建人snail基因真核表达载体并鉴定。方法:使用RT-PCR法获取人snail基因全长cDNA,经BamHI、EcoRI双酶切、连接,插入pcDNA3.1(+)真核表达载体,转化TOP10感受态细胞,用含氨苄青霉素的LB培养基筛选阳性克隆,提取质粒双酶切电泳及测序鉴定,瞬时转染siha细胞Western-blot从蛋白水平鉴定重组质粒在真核细胞内的表达。结果:pcDNA3.1-snail重组质粒经酶切电泳符合预期片段,测序鉴定插入片段与NCBIGenBank文库中人snail序列一致,重组质粒瞬时转染后snail蛋白表达量明显增高。结论:成功构建pcDNA3.1-snail重组质粒载体,为进一步探讨snail基因生物学功能奠定了基础。
简介:目的探讨自制冷冻载体冷冻保存昆明小鼠体内原核期胚胎的可行性。方法首先,比较了两种流行的商业化载体:开放式拉长麦管(openpulledstraw,OPS)和冷冻帽(cryotop)开展小鼠原核胚玻璃化冷冻保存效果。其次,以cryotop为对照,利用自制简易载体(cryotip)开展小鼠原核期胚胎的玻璃化冷冻保存。之后,利用ANOVA对各组胚胎在复苏后的体外培养卵裂率、囊胚率进行统计分析。结果OPS和cryotop两组之间,胚胎在玻璃化冷冻/复苏后发育的2-细胞率、4-细胞率和囊胚率差异均无显著性(P〉0.05),但cryotop冷冻效果更接近对照组;cryotip玻璃化冷冻载体与cryotop相比,胚胎复苏后各组差异均无显著性(P〉0.05),数值上除了2-细胞发育率外,cryotip其他几项结果都稍微高于cryotop组。结论OPS,cryotop,cryotip冷冻保存昆明小鼠体内原核期胚胎均是可行的;cryotop在冷冻效果上要优于OPS,笔者自制的cryotip因其成本低,制作简单,操作安全可靠,在实验中替代昂贵的商业化载体OPS和cryotop是可行的。
简介:传统认为只有真核生物才有蛋白质糖基化修饰现象,虽然在原核生物细胞中发现糖蛋白的存在已经有数十年,但是没有引起我们足够的重视。最近,在细菌中发现了蛋白质的糖基化修饰系统,最具代表性的是空肠弯曲弧菌的Ⅳ-糖基化修饰系统、脑膜炎奈瑟球菌和绿脓杆菌的0-糖基化修饰系统。这些糖基化修饰系统已成功地转移到大肠杆菌中,并且独立发挥其糖基化修饰作用。寡糖转移酶在修饰过程中起关键作用,且寡糖转移酶对糖底物的特异性要求非常低,这使得按照我们的需求来“定制糖蛋白”成为可能,并标志着“原核生物糖基工程”的到来,这将为糖结合疫苗的发展提供良好的契机。
简介:目的:构建天然免疫胞内识别受体核苷酸寡聚域1(NOD1)真核表达质粒。方法:NOD1基因片段经PCR扩增获得,经酶切后连接到真核表达载体pcDNA3/flag中,对挑选出的阳性克隆测序,将序列正确的重组质粒pnag—NOD1转染293T细胞,用Western印迹检测目的蛋白的表达,同时用NF-κB的萤光素酶报告基因检测NOD1蛋白的活性。结果:pflag-NOD1可以在真核细胞293T中表达,并可以增强NF-κB报告基因的转录活性。结论:构建了重组质粒pnag—NOD1,在细胞中表达NOD1后能够提高NF—κB转录的生物活性,为进一步研究NOD1的功能奠定了基础。
简介:为了探索梨树植物的开花调控机制,本研究以砂梨(PyruspyrifoliaNakai)叶片为材料,采用同源序列克隆法,进行了开花调控相关基因CONSTANS的克隆,命名为PyCO,GenBank登录号为KF246572。序列分析表明,该基因包含一个1023bp的开放阅读框,编码340个氨基酸,推测蛋白质分子量为37.81kD,等电点为5.95。PyCO蛋白具有典型的植物CO家族的结构特征,含有2个高度保守的B-box及CCT结构域。进化树分析表明,该氨基酸序列与苹果的同源性接近93%,与碧桃、可可树、草莓等其他高等植物的CO类蛋白同源性也在70%以上。原核表达获得了具有较高表达水平的融合蛋白,分子量约为58.5kD,为进一步探索梨树开花调控机理奠定了基础。
简介:心肌肌钙蛋白I(CardiacTroponinI,cTnI)作为诊断心肌损伤的血清标志物之一,同其它检测指标相比,具有出现时间早、诊断窗口期宽、特异性强、诊断阈值明确及检测快速等优点。由于心肌肌钙蛋白I为心肌细胞所特有,因此在心肌缺血性损伤、心肌非缺血性损害的诊断及骨骼肌损伤的鉴别诊断中得到了广泛应用。目前正逐渐取代包括CK-MB在内的其它血清酶检测指标而成为判断心肌损伤,特别是诊断急性心肌梗死(AcuteMyocardialInfarction.AMI)的“金标准”。同时心肌肌钙蛋白I对心肌疾病的病情监测、疗效观察及预后评估都具有较高的临床应用价值。本文对cTnI的国内外临床应用研究进展进行综述。