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  • 简介:目的:构建EF-1α-Flag到pcDNA3.0表达载体上,在哺乳动物细胞中表达并纯化延伸因子1α(EF-1α),测定其对体外蛋白翻译的影响。方法:通过PCR技术从293T细胞cDNA文库中扩增EF-1α基因片段,连接到pcDNA3.0载体上,经电泳、测序和转入细胞中检测EF-1α-Flag蛋白表达等方式验证所构建的重组质粒是否正确,然后经Flag肽置换法纯化出EF-1α蛋白用于体外蛋白翻译实验,萤光素酶活性检测翻译出的蛋白含量。结果:测序和蛋白表达鉴定结果表明扩增的EF-1α-Flag基因序列正确,所构建的重组载体在哺乳动物细胞中能获得表达;考马斯亮蓝染色发现经Flag肽置换的EF-1α蛋白纯度较高,在体外蛋白翻译实验中EF-1α蛋白能促进蛋白的翻译。结论:从哺乳动物细胞中纯化的EF-1α蛋白能促进蛋白翻译,可能与其作为翻译延伸因子相关,为进一步研究EF-1α的功能奠定了基础。

  • 标签: 延伸因子1α Flag肽置换 蛋白翻译
  • 简介:目的克隆并表达人心肌肌钙蛋白I(cTnl)cDNA,为高效获得大量蛋白、制备抗体打下基础。方法采用逆转录一聚合酶链反应(RT-PcR)和分子生物学技术克隆人cTnI基因,重组构建pcDNA3-cTnI真表达载体,转染人胚肾(HEK)293细胞,并用单克隆抗体检测特异性cTnI蛋白表达.结果克隆了cTnI的全长基因,构建了pcDNA3-cTnI真表达载体并成功地在真核细胞中获得了蛋白表达结论所表达的蛋白证明具有正确的cTnI免疫原性,为规模化制备cTnI蛋白奠定了基础。

  • 标签: 心肌肌钙蛋白I 基因 克隆 分子 基因表达
  • 简介:对于承受压力的壳体要求开孔用以安装电子产品等,由于开孔会使得壳体的强度明显削弱,需要在开孔处进行补强。本文介绍了只采用SHELL单元对壳体开孔补强进行有限元分析的简单适用的方法。

  • 标签: 圆柱壳体 开孔强度 有限元 SHELL单元
  • 简介:摘要塑料模壳作为一种新型的模板体系,近年来在建筑工程中得到广泛的应用,由塑料模壳形成的密肋楼盖体系,由于其具有优良的经济效益,与传统的密肋梁结构体系相比,它具有施工便捷、周期短、费用低、外观新颖、降低噪音等天然优势。实践证明采用塑料模壳工艺体系,明显降低了钢筋、混凝土用量,提高了工具周转率,减少了劳动强度,保证了工程质量,值得进一步推广应用。

  • 标签: 塑料模壳 建筑工程 地下车库 密肋梁结构体系 经济效益
  • 简介:摘要:轻量化属于当前汽车工业的一个主流研究方向。通过汽车自重的降低减少油耗,利用铝合金等相关轻质材料,并借助制造工艺得以实现。因为低压铸造一方面能获得优质铸件,另一方面还可以复杂的薄壁件,属于当前铸件的重要的生产工艺,而本文将对设计压铸铝合金壳体的相关要点加以简要分析。

  • 标签: 压铸工艺 壳体设计 铝合金 汽车
  • 简介:摘要: 目的 获得人载脂蛋白 A-I (apoA-I)重组蛋白表达的最佳条件。方法 研究由诱导温度、 IPTG终浓度、 IPTG诱导时间等对 apoA-I重组蛋白表达量的影响。 结果 SDS-PAGE验证各不同条件下获得目的蛋白条带为 29kd;结果显示重组大肠杆菌菌株的最佳条件为 32℃、 IPTG诱导浓度为 1.0mmol/L以及 IPTG诱导时间为 3h。结论 成功在大肠杆菌中诱导表达出来 apoA-I,并筛选出 apoA-I原表达的最优条件。

  • 标签: 载脂蛋白 A-I 原核表达 条件优化
  • 简介:摘要目的获得人载脂蛋白A-I(apoA-I)重组蛋白表达的最佳条件。方法研究由诱导温度、IPTG终浓度、IPTG诱导时间等对apoA-I重组蛋白表达量的影响。结果SDS-PAGE验证各不同条件下获得目的蛋白条带为29kd;结果显示重组大肠杆菌菌株的最佳条件为32℃、IPTG诱导浓度为1.0mmol/L以及IPTG诱导时间为3h。结论成功在大肠杆菌中诱导表达出来apoA-I,并筛选出apoA-I原表达的最优条件。

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  • 简介:为了进一步明确苹果茎痘病毒(Applestempittingvirus,ASPV)的分子变异及株系分化,制备相应特异性抗血清。本研究以库尔勒地区种植的感染ASPV的鸭梨(Y)枝条韧皮部为试材,采用RT-PCR技术扩增ASPVCP基因,克隆、测序,获得了鸭梨分离物外壳蛋白(ASVPCP-Y)基因,将该CP基因连接到表达载体PET-28a上,转化到大肠杆菌BL21(DE3),1mmol/LIPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳分析。研究结果表明,获得的鸭梨ASPVCP基因全长1194bp,推测编码397个氨基酸,与已报道的ASPV分离物的氨基酸序列同源性为70%左右。进化分析结果显示,ASPVCP基因的分离物可聚为三个类群:第一类群的寄主为苹果,第二类群的寄主为梨(除了NC_003462,苹果),ASPVCP-Y归入第三类群。CP基因在大肠杆菌中诱导表达,其融合蛋白分子量约为42kD。克隆的鸭梨ASPVCP基因及构建的原表达载体为制备ASPV重组CP基因多克隆抗体及ASPV的分子生物学的进一步研究奠定了基础。

  • 标签: 苹果茎痘病毒 外壳蛋白 原核表达
  • 简介:目的探索构建针对人类转运蛋白2(KPNA2)基因的重组慢病毒干扰RNA(shRNA)载体的方法,研究其对人骨肉瘤细胞株MG63的沉默效率。方法针对KPNA2基因设计小片段干扰序列。加入AgeⅠ酶和EcoRⅠ酶酶切位点,根据设计好的序列合成单链DNAoligo并退火合成双链DNAoligo。将合成好的双链DNAoligo与GV115载体重组,形成GV115-shRNA慢病毒载体。聚合酶链式反应(PCR)法鉴定筛选出阳性重组子,经测序后包装慢病毒载体。荧光法测定病毒滴度,重组慢病毒感染骨肉瘤细胞株MG63,通过显微镜观察细胞中绿色荧光蛋白(GFP)的表达来计算其转染效率。RT-PCR法检测重组慢病毒RNA干扰载体对人骨肉瘤细胞株MG63中KPNA2表达的沉默效率。实验结果数据以均数±标准差(sx±)表示,应用SPSS13.0统计软件分析,两组均数间的比较采用t检验,以P<0.05为差异有统计意义。结果经PCR分析和测序证实,成功构建KPNA2基因重组慢病毒RNA干扰载体;荧光法测定病毒滴度为4×108TU/ml;荧光显微镜下观察GFP,显示细胞感染效率达到80%以上;RT-PCR检测对照组及实验组KPNA2mRNA表达分别为0.991±0.087vs.0.216±0.012,差异有统计学意义(P<0.01)。结论KPNA2基因重组慢病毒RNA干扰载体构建成功,并有效干扰人骨肉瘤细胞株MG63中KPNA2mRNA的表达。

  • 标签: 核转运蛋白2 慢病毒载体 RNA干扰 重组质粒
  • 简介:丝氨酸乙酰转移酶(serineacetyltransferase,SAT)是甲硫氨酸和半胱氨酸合成途径的关键酶,利用该基因提高作物中甲硫氨酸水平具有广阔的应用前景。为了研究拟南芥SAT1(ArabidopsisthalianaSAT1)基因的蛋白表达情况及相关功能,构建了带有His标签的AtSAT1基因原表达载体pET-30b(+)-SAT1-His(6)。将其导入大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中并用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,经固定化金属离子亲和层析(IMAC)纯化获得了抗原蛋白SAT1-His(6)。该抗原蛋白经免疫兔子,成功制备了具有较高特异性和灵敏性的SAT1蛋白多克隆抗体。Westernblotting表明,该抗体可用来检测转AtSAT1基因的转基因玉米株系中SAT1蛋白的积累量,为后期对该基因开展进一步深入研究具有重要意义。

  • 标签: 拟南芥 丝氨酸乙酰转移酶 原核表达 多克隆抗体
  • 简介:摘要目的探讨基质蛋白22(NMP22)及E-钙黏蛋白(E-Cad)在膀胱癌早期诊断中的临床价值。方法收集本院自2018年1月至2021年1月收治的61例确诊为原发性膀胱癌患者的尿液样本,设为膀胱癌组,并选取同期60例健康者的尿液样本作为对照组,采用酶免疫分析法测定两组NMP22表达水平及定量夹心酶免疫测定技术测定E-Cad表达水平。结果与对照组相比,膀胱癌组的NMP22、E-Cad均升高,差异均有统计学意义(均P<0.001)。在膀胱癌组中,淋巴结转移阳性患者的E-Cad水平显著高于淋巴结转移阴性患者,差异有统计学意义(P=0.007)。受试者工作特征(ROC)曲线分析得出,NMP22诊断膀胱癌的灵敏度及特异度分别为84.4%和59.3%,E-Cad诊断膀胱癌的灵敏度及特异度分别为76.9%和50.0%。结论NMP22、E-Cad均可以作为检测膀胱癌的良好指标,联合NMP22及E-Cad检测可以弥补各指标检测的弊端,显著提高膀胱癌的早期诊断率。

  • 标签: 膀胱肿瘤 核蛋白质类 E-钙黏蛋白
  • 简介:目的:SARA/SBD是纤维化形成过程中的负性调节因子。原表达、纯化含反式激活蛋白(TAT)蛋白转导域(PTD)的TATPTD-SARA/SBD融合蛋白,并鉴定其生物学活性。方法:将TATPTD-SARA/SBD基因克隆入带His标签的原表达载体pET-44a(+)中,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,表达产物经Ni2+-NTA亲和层析柱纯化后,SDS-PAGE和Western印迹鉴定目的蛋白;用人腹膜间皮细胞系(HPMC),通过免疫细胞化学方法检测其穿膜能力,及与TGF-β1信号通路中Smad2因子的共定位情况。结果:用基因工程方法表达和纯化了TATPTD-SARA/SBD融合蛋白,目的蛋白约占菌体总蛋白的20%左右,且以可溶形式表达,经Ni2+-NTA纯化后,所获蛋白纯度高于95%(HPLC归一法);功能学实验结果显示该蛋白能穿过胞膜,主要定位于胞,且与Smad2因子具有内共定位。结论:表达了TATPTD-SARA/SBD融合蛋白,该蛋白具有生物学活性。

  • 标签: 蛋白转导域 SARA/SBD融合蛋白 原核表达 纯化 生物学活性
  • 简介:摘要目的构建并鉴定表达新型冠状病毒衣壳(nucleocapsid,N)蛋白的基因重组BCG。方法利用PCR技术从质粒pUC57-N(Kan+抗性)中获得新型冠状病毒N蛋白全长基因。将N基因连接到大肠埃希菌-BCG穿梭表达质粒pMV261,进行酶切、PCR及测序鉴定。重组质粒经电转化导入感受态BCG,通过蛋白印迹法鉴定目的基因在重组BCG中的表达。结果经过PCR扩增获得1 260 bp的N基因,构建的重组表达质粒pMV261-N序列完整,插入的基因片段与美国国家分子生物学信息资源中心报道的新型冠状病毒N蛋白全长基因的大小及序列一致。重组质粒能够在BCG中表达相对分子质量约为46 000的目的蛋白蛋白印迹法显示该蛋白能被抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体识别。结论构建的重组BCG能稳定表达新型冠状病毒N蛋白,为开发新型冠状病毒N基因重组BCG疫苗奠定了基础。

  • 标签: 新型冠状病毒 卡介苗 核衣壳蛋白
  • 简介:目的:构建蜱传脑炎病毒(TBEV)结构蛋白E的原表达载体,表达重组蛋白。方法:PCR扩增E蛋白全长基因片段,插入原表达载体pET-32a并转化大肠杆菌进行诱导表达,镍柱纯化、复性。结果:E蛋白在大肠杆菌中获得表达,表达量达60mg/L;重组E蛋白能与人抗TBEV多克隆抗体产生特异反应;用重组E抗原免疫家兔后,能检测到较高的抗体水平。结论:原表达的E抗原蛋白具有抗体结合活性,可用于制备ELISA诊断试剂。

  • 标签: 蜱传脑炎病毒 E蛋白 原核表达
  • 简介:摘要端粒酶通过改变端粒的长度影响细胞功能,成为端粒相关蛋白调控端粒长度的核心,维持着端粒及染色体的稳定。本项目对正常与退变髓组织POT1、TPP1、TERT基因和蛋白表达情况进行检测,结果提示正常髓细胞组织POT1和TPP1基因表达水平明显高于退变髓组织。正常髓组织POT1和TPP1蛋白表达水平明显高于退变髓组织。得出POT1和TPP1的降低导致hTERT表达降低,加速了细胞和组织的衰老过程。

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  • 简介:目的探讨人骨形成蛋白-2(BMP-2)全长基因的克隆,及其真表达重组子构建方法。方法采用Trizol法从人髁状突骨组织中提取制备总RNA,利用逆转录技术转录出BMP-2cDNA,以其为模版,PCR扩增出BMP-2全长基因,与真表达载体pcDNA3.1(+)连接.构建真表达重组子pcDNA3.1(+)/BMP-2.经酶切和序列分析鉴定重组子的构建情况。结果PCR扩增产物在1200000处有扩增条带.与目的基因大小相符.重组质粒经限制性内切酶HindⅢ和XbaⅠ双酶切后。得到5400000和1200000的BMP-2条带,BMP-2基因已成功克隆且成功与pcDNA3.1(+)连接。结论成功克隆出人BMP-2基因,并构建其真表达重组子pcDNA3.1/BMP-2,为进一步研究BMP-2的功能、BMP-2基因在骨髓间充质细胞(hMSCs)中表达以及在骨组织工程中的应用研究奠定了基础.

  • 标签: 骨形成蛋白-2 基因克隆 真核表达载体