简介:目的构建以大鼠CTGF和TIMP-1基因为靶点的双重RNA干扰表达载体质粒,以检测其转染肝星状细胞的效率.方法筛选出对CTGF和TIMP-1基因最有效的RNA干扰靶位,各设计1对含有短发夹结构的RNA干扰靶点序列,分别克隆到质粒载体psiRNA-DUO-GFPzeo,构建含目的靶基因片段的重组质粒载体psiRNA-GFP-CT-GF、psiRNA-GFP-TIMP-1和psiRNA-GFP-Com(含有CTGF和TIMP-1),进行酶切和测序鉴定.将构建成功的重组质粒psiRNA-GFP-CTGF、psiRNA-GFP-TIMP-1和psiRNA-GFP-Com转染大鼠肝星状细胞,在荧光显微镜下观察质粒转染情况,用流式细胞仪检测转染效率.结果酶切与测序结果提示重组质粒psiRNA-GFP-CTGF、psiR-NA-GFP-TIMP-1和psiRNA-GFP-Com成功构建;成功将重组质粒psiRNA-GFP-CTGF、psiRNA-GFP-TIMP-1和psiRNA-GFP-Com转染肝星状细胞,在24小时,空质粒组、CTGF组、TIMP-1组和CTGF+TIMP-1组转染效率分别为15±2%、13±1%、15±1%和14±2%,均低于质粒psiRNA-GFP-Com转染组(Com组,20±2%,P〈0.05);在48小时,空质粒组、CTGF组、TIMP-1组和CTGF+TIMP-1组转染效率分别为10±2%、9±1%、8±2%和10±1%,均低于Com组的15±2%(P〈0.05).结论成功构建靶向大鼠CTGF和TIMP-1最有效的RNA干扰靶位的双重RNA干扰表达质粒,能转染至肝星状细胞,并且psiRNA-GFP-Com转染效率最高.
简介:在西力国家,酗酒历来是导致严重肝脏疾病的首要因素.我国近年来由酒精所致的肝损害亦呈逐年上升趋势,酒精已成为继病毒性肝炎后导致肝损害的第二大病因[1].典型的酒精性肝病(ALD)临床上表现为脂肪肝和肝肿大、酒精性肝炎、酒精性肝纤维化,最终将发展为不可逆性肝硬化.尽管ALD的发病机制较为复杂,但大量资料表明,酒精代谢产物乙醛是造成肝脏和其他脏器损害的主要元凶[2].乙醇脱氢酶(ADH)和肝脏微粒体乙醇氧化系统(MEOS)通路均可产生毒性代谢产物乙醛,乙醛继而与机体蛋白质结合形成复合舷物,进一步导致蛋白酶失活、DNA修复蛋白功能损害、自身抗体形成、谷胱甘肽耗竭、线粒体损伤和氧利用障碍[3].