简介:目的构建大鼠nelin基因干扰质粒并对其进行体外抑制效果验证,为研究nelin在心脏发育、心肌肥厚、心衰及其它心脏疾病中的作用提供有效的研究工具。方法提取大鼠心肌组织RNA,逆转录为cDNA,设计合成含BamHI和EcoRI酶切位点的引物,以大鼠cDNA为模板PCR扩增获得nelin基因,定向克隆入pEGFP-N1-3FLAG载体,测序验证。以克隆得到的大鼠nelin基因为模板,设计合成候选干扰序列,亚克隆至pGCSIL-U6载体,获得干扰质粒。以nelin基因干扰质粒和重组表达质粒共转染HEK293T细胞,WesternBlot方法检测干扰效果。结果成功克隆了大鼠nelin基因并构建了nelin基因重组表达载体pEGFP-N1-3FLAG-rNelin。设计构建的4个干扰质粒(靶位点分别为+370-388位,+376-394位,+545-563位,+1206-1224,命名为pGCSIL-U6-nelin/siteⅠ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ)均可显著降低nelin基因的表达,尤以靶向(+370-388位)位点即pGCSIL-U6/nelin-siteI质粒的干扰效果最佳。结论本实验构建的大鼠nelin基因特异性干扰质粒能从蛋白水平上高效特异地抑制ne-lin基因表达,为进一步开展其功能研究奠定了基础。
简介:目的应用小分子干扰RNA(smallinterferenceRNA,siRNA)干扰KAI1基因在人胰腺癌T3细胞系的表达,为基因治疗胰腺癌打下基础。方法针对KAI1基因CD82片段序列设计A、B、C、D4个siRNA靶序列,构建针对KAI1基因(CD82)含siRNA片段的慢病毒载体。以脂质体2000转染T3细胞,测定病毒滴度。以空载体、含不同靶序列siRNAd1载体的病毒感染T3细胞(MOI=5),采用实时PCR方法检测CD82mRNA的表达。结果正常对照组、空载体对照组、A靶序列组、B靶序列组、C靶序列组和D靶序列组CD82mRNA表达量分别为1.398±0.242、1.311±0.048、0.664±0.093、0.345±0.032、0.641±0.049和0.147±0.049,各靶序列组的表达量明显低于空载体对照组(P〈0.01)。结论府用RNAi可有效抑制r13细胞KAI1基因CD82片段的表达。
简介:经鼻持续气道正压通气治疗(nCPAP)是目前公认的睡眠呼吸紊乱的“金治疗”方法,如果压力滴定正确.nCPAP的治疗效果可以接近100%。但仍存在面罩问题、气流刺激以及鼻部干燥或充血等引起的不良反应,而且使用不方便,费用较高,患者的耐受性和顺应性对治疗效果影响较大。
简介:植入式心脏装置(心血管植入式电子装置,cardiovascularimplantableelectronicdevice,CIED),包括起搏器、植入式心脏转复除颤器(implantablecardioverterdefibrillator,ICD)、心脏再同步治疗除颤器(cardiacresynchronizationtherapy-defibrillator,CRT-D)和心脏再同步治疗起搏器(cardiacresynchronizationtherapy-pacemaker,CRT-P),术后患者需要长期随访。近年来,随着植入性心脏设备植入量的快速增加,常规的定期门诊随访模式已经不能满足临床医师对这些患者的及时、全面的管理。如何进行有效的术后随访及管理,及时发现患者的病情变化,成为临床需要面对的问题。
简介:目的本实验探讨靶向沉默CDCA5基因的表达对人乳腺癌细胞增殖的影响及其主要机制。方法采用Westernblot检测乳腺癌组织、癌旁正常组织和人乳腺癌细胞系MCF-7、MDA—MB-231及MDA—MB-435s细胞中CDCA5蛋白的表达。针对CDCA5基因的siRNA,设阴性对照组siRNA—NC及空白对照组Blank。PCR检测各组对CDCA5基因的沉默效果。MTT法检测siRNA、siRNA-NC和Blank各组细胞增殖能力,流式细胞仪分别检测3组细胞周期的变化。Westernblot用于分析P1k1、SA2和pSA2蛋白表达情况。结果CDCA5在乳腺癌组织中的表达明显高于癌旁正常组织。人乳腺癌细胞系MDA—MB-435s中CDCA5蛋白的表达明显高于MCF-7和MDA-MB-231细胞系。siRNA在各组中有最强的基因沉默效果,与siRNA—NC和Blank组相比,siRNA组细胞增殖能力明显降低(P〈0.05),处于细胞周期G2/M期的细胞数量明显增多(P〈0.05)。沉默CDCA5基因后Plk1和pSA2蛋白表达明显降低。结论沉默CDCA5基因可有效抑制乳腺癌细胞增殖,这可能与下调CDCA5/Plk1/SA2信号通路从而使细胞周期被阻滞在G2/M期有关。
简介:目的探讨RNA干扰下调叉头转录因子M1(ForkheadboxproteinM1,FoxMl)基因小干扰RNA(smallinterferingRNA,siRNA)对胰腺癌细胞化疗药物敏感性的影响及分子机制。方法设计合成3个FoxM1siRNA,转染人胰腺癌Panc-1细胞后采用定量PCR方法筛选下调FoxM1mRNA效果最好的siRNA;然后以该siRNA转染Panc-1细胞后,分别以实时定量PCR检测各组细胞FoxM1mRNA表达情况;以不同浓度siRNA转染胰腺癌细胞后,分别以MTT法检测吉西他滨(20nM,Gemcitabine)对各组细胞生长和化疗敏感性的影响;以蛋白质印迹方法检测Akt磷酸化情况。结果3个siRNA均明显下调FoxM1mRNA水平,以S3效果最好。MTT结果显示,Con-A+Gem组、Con—B+Gem组、siRNA(3.125nM)+GemsiRNA、siRNA(6.25nM)+Gem、siRNA(12.5nM)+Gem组抑制率分别为17.78%、17.56%、35.39%、52.81%及70.98%。蛋白质印迹检测发现,siRNA转染组Akt磷酸化水平明显下调。结论FoxM1基因siRNA可促进胰腺癌细胞化疗敏感性,通过下调Akt磷酸化水平可能是其重要机制之一,但其内在的分子机制尚需进一步探讨。
简介:目的:探讨浆细胞样树突状细胞(pDC)、干扰素α(IFN-α)及CD4^+CD25^+调节性T细胞(Treg细胞)在Graves病(GD)中的免疫致病机制。方法:收集GD患者及正常对照者的外周血及甲状腺组织,利用实时PCR、免疫组化、流式细胞仪、细胞分选及纯化等技术对组织或体外实验中的细胞数目、mRNA水平或蛋白水平进行分析比较。结果:GD患者中外周血血清IFN-α水平升高,分泌IFN-α的pDC亚群细胞数目增加;IFN-α还可以诱导甲状腺细胞表达IFN-α诱导基因(IFIGs)、人类白细胞抗原(HLA)-DR基因和促甲状腺激素受体(TSHR)基因的mRNA;GD患者外周血中Treg细胞比例降低;DC使Treg细胞更易凋亡。结论:GD的发病与pDC比例增多、IFN-α水平升高以及Treg细胞比例下降等多种免疫调节因素相关。
简介:目的:通过检测支气管哮喘合并肺炎支原体(MP)感染小鼠模型外周血及支气管肺泡灌洗液(BLAF)细胞因子的变化,分析MP感染后是否通过影响哮喘发病相关细胞因子而发挥作用。方法:6~8周的清洁级雌性BALB/c小鼠24只,随机分成哮喘MP感染组(8只)、哮喘非MP感染组(8只)、正常对照组(8只),并建立相应的小鼠动物模型。运用双抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)法对各组BLAF和外周血白介素(IL)-9、IL-17、γ干扰素(IFN-γ)等细胞因子进行检测并对比组间差异。结果:BLAF中IL-9水平在哮喘MP感染模型组高于非MP感染组及正常对照组,差异有统计学意义(P〈0.01),哮喘非MP感染组也高于正常对照组(P〈0.01);IFN-γ水平在哮喘MP感染模型组低于非MP感染组及正常对照组,哮喘非MP感染组也低于正常对照组,且均有统计学差异(均P〈0.01);IL-17水平各组间无显著差异。在各组小鼠外周血中IL-9、IL-17、IFN-γ水平变化亦符合上述改变。结论:哮喘MP感染小鼠BLAF和外周血IL-9水平明显升高,IFN-γ水平则明显下降,IL-17水平无明显变化。
简介:目的总结合并窦性心动过缓的遗传性长QT综合征(以下简称遗传性LQTS)患者植入永久起搏器和埋藏式心脏复律除颤器(以下简称ICD)的治疗效果,对比分析这两种治疗在预防患者猝死中的差异。方法对我院从2003年6月到2013年6月出院诊断为遗传性LQTS合并窦性心动过缓、植入了永久起搏器或ICD的全部21例患者,结合门诊、电话和程控随访了解患者的生存状况、手术并发症以及晕厥、室性恶性心律失常的发作情况。结果起搏器组男性2例,女性9例,年龄39.3±14.3岁,随访时间50.6±26.3个月,1例患者猝死,2例患者再发晕厥前兆,其中1例最终更换为ICD。ICD组男性2例,女性8例,年龄34.5±11.9岁,随访时间61.4±43.5个月,3例患者接受了ICD的适当治疗,另2例患者接受了ICD的不适当治疗,1例患者术后出现囊袋感染,1例患者更换为永久起搏器。治疗有效率在起搏器组及ICD组分别为72.7%(8/11)和100.0%(10/10),未达到统计学差异(p=0.21)。不良事件发生率在起搏器组及ICD组分别为27.3%(3/11)和30.0%(3/10),也未达到统计学差异(p=0.63)。结论对于不能植入ICD的合并窦性心动过缓的遗传性LQTS患者,植入永久起搏器可能是一个较好的替代方法,但对于QTc≥539ms的患者,只有植入ICD才能预防猝死。植入ICD后长期无心脏事件发生的患者,根据患者意愿,可考虑更换为永久起搏器。