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9 个结果
  • 简介:应用DNA聚合酶链式反应(PCR)技术,对p16抑癌基因(CDKN2)进行体外定点突变,在p16cDNA中引入第48位密码子CCG(Pro)→CTG(Leu)和第74位密码子GAC(Asp)→AAC(Asn)突变,构建了p16-P48L和p16-D74N突变体。野生型和突变型p16cDNA克隆于pcDNA3构建pCMV-p16、pCMV-p16P48L和pCMV-p16D74N真核表达载体,导入纯合缺失p16基因的人肺癌细胞株H460,经RNA点杂交、RNA印迹和细胞免疫化学染色,检测到P16表达。通过比较表达野生型和突变型P16的H460细胞在~3H-TdR掺入及细胞所在周期的差异,证实P16表达抑制细胞进入S期,而P48L和D74N突变体对细胞进入S期没有什么影响,提示P48L和D74N突变导致P16蛋白功能丧失。

  • 标签: P16基因 体外定点突变 基因表达 细胞周期
  • 简介:P16ink4是CDK抑制蛋白,参与调控细胞G1期至S期的转换。目前发现P16`(ink4)基因损伤与多种肿瘤的发生、发展有关,可能是功能上非常重要的抑癌基因。为了研究该基因的功能,以及突变对该基因功能的影响,本文应用RT-PCR方法,从Hela细胞中克隆了P16ink4cDNA。扩增得到556bp片段(包括引物两端酶切位点的16bp)克隆于M13载体,测定了其DNA序列。该序列包括了P16ink4cDNA编码区全部471bp,以及3’端69bp序列。表明P16ink4cDNA已成功地得到克隆。

  • 标签: P16ink4/CDKN2/MTS1 CDNA 序列测定 RT-PCR
  • 简介:目的:研究SOX4和p53蛋白之间的相互作用。方法:应用GSTpull-down、免疫共沉淀实验验证相互作用。结果:GSTpulldown实验证实SOX4能结合GST-p53融合蛋白,但不能结合GST蛋白;免疫共沉淀实验也证明,SOX4与p53能在细胞内发生相互作用。结论:SOX4能与p53发生相互作用,为p53信号通路的研究提供了新的线索。

  • 标签: SOX4 P53 相互作用
  • 简介:利用重叠延伸PCR法对扩展青霉碱性脂肪酶(PEL)基因进行体外定点突变,并构建了含突变基因的重组质粒pPIC3.5K-lip-D92P.将该质粒在毕赤酵母GS115菌株中表达.与野生型表达产物PEL-GS相比较,突变体表达产物PEL-D92P-GS最适作用温度为45℃,比野生型提高了5℃;其热稳定性与野生型相当;突变体在40℃下的表达量为109U/mL,约为野生型的29%.结果分析表明,Pro替代Asp92后,可能是由于Pro一级结构的特点,使酶结构更加稳定,在高温下更适于与底物结合.

  • 标签: 扩展青霉 碱性脂肪酶 最适作用温度 定点突变 重叠延伸PCR法 蛋白质工程
  • 简介:拟建立抗HIV-p24蛋白的单克隆抗体细胞株及双抗体夹心法,用于检测艾滋病病人血清中的p24抗原.用纯化的基因工程表达的HIV-p24蛋白免疫BALB/c小鼠.取免疫小鼠的脾细胞和小鼠骨髓瘤Sp2/0细胞融合,有限稀释法克隆细胞,ELISA筛选特异性抗体.结果克隆筛选出12株细胞,初步建立了检测HIV-p24抗原的双抗体夹心酶联免疫吸附试验.本方法为监控艾滋病病毒感染的窗口期和艾滋病病人临床治疗效果提供了检测手段.

  • 标签: 抗HIV-P24单克隆抗体细胞株 重组HIV-P24蛋白 酶联免疫吸附试验 艾滋病毒
  • 简介:在大肠杆菌中,利用新构建的含T7g-10LRBS以及λ-PR启动子的新型原核表达载体,通过表达gag-pol基因片段,获得了具有天然序列的人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)核心蛋白p24的高效表达。克隆的gag-pol基因片段在其阅读框架移位区域插入了4bp碱基,其表达的病毒蛋白酶在阅读框架上与gag一致,从而实现了对gag-pol融合蛋白的有效加工,产生成熟的核心蛋白p24及其它产物。重组p24以可溶形式存在,可以被抗p24的单克隆抗体特异识别。测定的N端8个氨基酸序列与从病毒纯化的p24完全一致。在使用硫酸铵沉淀后,采用两步离子柱层析,可将重组蛋白纯化到95%以上的纯度。结果表明,纯化的p24可以作为特异性很强的试剂而用于HIV感染的诊断及病情的预后,并可用于p24的生化及结构分析。

  • 标签: HIV-1 核心蛋白 表达 纯化 鉴定
  • 简介:目的:探讨Neu-p11对自发性高血压大鼠(SHR)血压及血清一氧化氮(NO)和内皮素-1(ET-1)含量的影响。方法:40只SHR大鼠随机分为4组(n=10):SHR模型组、Neu-p11低剂量组(5mg/kg)、Neu-p11中剂量组(15mg/kg)和Neu-p11高剂量组(50mg/kg)。另取10只WKY大鼠设为正常对照组。每日腹腔注射药物一次,连续5周,观察药物对大鼠收缩压、血清NO及ET-1含量的影响。结果:Neu-p11能有效降低自发性高血压大鼠的收缩压,Neup11低剂量组、Neu-p11中剂量组和Neu-p11高剂量组与SHR组相比具有显著性差异(P<0.05);Neu-p11能升高自发性高血压大鼠血清NO含量,降低自发性高血压大鼠血清ET-1含量,与SHR组相比,各组均有显著性差异(P<0.05)。结论:Neu-p11具有抗高血压作用,其作用可能与促进血清中的NO合成与释放以及降低血清ET-1的含量有关。

  • 标签: Neu-p11 自发性高血压大鼠 血压 NO ET-1
  • 简介:随着我国医疗水平的不断提高,我国在糖尿病与糖尿病肾病上的研究加深,对TLR4/P38Mapks信号通路与糖尿病肾病相关性的研究更进一步,笔者在前人探究结果的基础上,开展探究活动。糖尿病与糖尿病肾病患者的TLR4/P38Mapks表达都高于健康人群,因此TLR4/P38Mapks表达与糖尿病肾病患者的病情存在密切关系,且糖尿病与糖尿病肾病患者的TLR4/P38Mapks表达与尿蛋白排泄率、尿素氮之间存在正相关,而DN组TLR4/P38Mapks表达又与患者血清中的IL-6、IL-8之间也存在正相关关系。本文先是对MAPKs信号通路生化特征与糖尿病肾病的相关性进行概述,又详细阐述了糖尿病肾病与TLR4的相关性。

  • 标签: TLR4/P38Mapks 信号通路 糖尿病肾病 相关性 研究进展
  • 简介:目的:初步探究十五肽BPC-157调节人脐静脉内皮细胞(HUVEC)功能的信号通路作用机制。方法:首先利用生物芯片筛选BPC-157参与激活的细胞信号转导通路途径,进而通过real—timePCR证实BPC-157对候选信号通路中相关基因的mRNA表达水平的影响,最后采用Western印迹观察BPC-157对候选信号通路中相关蛋白的磷酸化水平影响。结果:10μg/mLBPC-157作用于HUVEC24h后,信号转导通路发现者芯片结果显示,与18条信号转导通路相关的96个关键基因中分别有4个基因的mRNA表达水平上调和下调,其中与MAPK信号通路相关的3个关键基因c—ns、c—Jun和Egr-1的mRNA表达水平显著性上调;低剂量BPC-157(1Ixg/mL)作用于HUVEC12h后,能够促进早期即刻基因c—ns、c—Jun和酝卜1的mRNA表达水平;10μg/mLBPC-157作用于HUVEC30min后,可明显促进ERKl/2、p38蛋白磷酸化。结论:BPC-157可能通过活化MAPK信号转导通路途径后,激活下游早期即刻基因转录,启动靶基因的表达,从而发挥促进HUVEC增殖、迁移等功能。

  • 标签: BPC-157 人脐静脉内皮细胞 基因芯片 信号通路