简介：摘要目的利用转录组测序(RNA-seq)和生物信息学技术对低氧与常氧条件下人视网膜色素上皮细胞系ARPE-19细胞的差异表达基因(DEGs)及信号通路的变化进行分析，探讨低氧诱导ARPE-19细胞损伤的生物学机制。方法将ARPE-19细胞分为低氧处理组和常氧对照组，分别采用体积分数1%和21% O2处理细胞8、24、48、72 h，采用实时荧光定量PCR法检测不同时间点血管内皮生长因子(VEGF)和低氧诱导因子(HIF-1α)mRNA相对表达量。分别对2个组处理后8 h和24 h的ARPE-19细胞进行RNA-seq及生物信息学分析，以|log2FC|≥1且P≤0.05为条件筛选出DEGs，并对DEGs进行聚类热图分析、基因本体论(GO)功能富集分析、京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析及蛋白-蛋白互作(PPI)网络分析。采用实时荧光定量PCR法检测低氧处理ARPE-19细胞24 h后DEGs中可能与低氧有关的基因mRNA相对表达量。采用细胞活力检测试剂盒验证2个组不同时间点低氧对ARPE-19细胞的损伤作用。结果低氧处理组8、24、48、72 h VEGF和低氧处理组8、24、48 h HIF-1α mRNA相对表达量均高于常氧对照组，差异均有统计学意义(均P<0.05)，其中低氧处理后8 h和24 h各因子mRNA表达差异较大。低氧诱导8 h，低氧处理组与常氧对照组间筛选显著DEGs共62个，其中显著上调基因45个，显著下调基因17个；低氧诱导24 h，2个组间筛选显著DEGs共255个，其中显著上调基因228个，显著下调基因27个。DEGs的GO功能分析主要富集在蛋白质降解、核苷酸生物合成及物质转运等进程。KEGG通路分析主要富集在PI3K-Akt、cGMP-PKG以及其他与代谢、细胞周期、细胞生长和细胞凋亡密切相关的信号通路。PPI网络分析发现核心基因HPCA、MT3和NOS3等。实时荧光定量PCR检测结果示，低氧处理ARPE-19细胞24 h后，低氧相关基因DEPP1、NPPB、PDZK1、HILPDA、TCEA3、NDRG1和RORC的mRNA表达水平升高，TFRC、NQO1的mRNA表达水平降低，差异均有统计学意义(均P<0.05)。低氧诱导ARPE-19细胞后8 h和24 h，细胞形态均正常，生长状态较好，未出现死亡细胞，低氧诱导48 h后ARPE-19细胞出现死亡，低氧诱导72 h后死亡细胞数量增加。结论与代谢相关的PI3K-Akt、cGMP-PKG信号通路可能参与低氧诱导的ARPE-19细胞损伤作用，HPCA、MT3、NOS3核心基因可作为功能性靶基因，在低氧反应中起到关键作用。

简介：摘要目的分析高糖诱导的BV2小胶质细胞基因表达水平和信号通路改变，初步探讨转胶蛋白-2 (TAGLN2）调控细胞炎症反应和代谢进程的机制。方法基础研究。BV2细胞分为甘露醇（Man）组、葡萄糖（Glu）组、过表达对照（Con）Glu组、过表达TAGLN2 Glu组、沉默Con Glu （shCon Glu）组、沉默TAGLN2 Glu （shTAGLN2 Glu）组。Man组细胞置于含25 mmol/L Man、25 mmol/L Glu的改良Eagle培养基（DMEM培养基）中培养；Glu组、Con Glu组、TAGLN2 Glu组、shCon Glu组、shTAGLN2 Glu组细胞置于含50 mmol/L葡萄糖的DMEM培养基中培养。培养24 h后，采用高通量测序技术对各组细胞进行转录组测序，筛选显著差异表达基因（DEG）。DEG筛选标准为|log2（差异表达倍数）|≥1且P≤0.05。对筛选得到的DEG进行基因注释（GO）功能富集分析、京都基因与基因组百科全书（KEGG）的信号通路富集分析和蛋白-蛋白互作网络分析。采用实时聚合酶链反应（RT-PCR）检测DEG mRNA相对表达量。组间数据比较采用独立样本t检验。结果与Man组比较，Glu组共筛选出517个DEG，其中上调、下调基因分别为277、240个。KEGG通路分析结果显示，上调的DEG显著富集在核因子（NF）-κB和Jak-信号转导和转录激活因子（STAT）信号通路等免疫系统进程；下调的DEG显著富集在糖胺多聚糖的降解和甘油酯等代谢进程。与Con Glu组比较，TAGLN2 Glu组共筛选出480个DEG，其中上调、下调基因分别为147、333个。上调的DEG显著富集在脂肪酸、甘油脂和丙酮酸等代谢进程；下调的DEG显著富集在NF-κB、Jak-STAT和肿瘤坏死因子（TNF）信号通路等免疫系统进程。与shCon Glu组比较，shTAGLN2 Glu组共筛选出582个DEG，其中上调、下调基因分别为423、159个。上调的DEG显著富集在TNF、趋化因子信号通路等免疫系统进程；下调的DEG基因主要富集在模式识别受体信号通路。RT-PCR检测结果显示，与Con Glu组比较，TAGLN2 Glu组细胞中Card11 （t= 13.530）、Icos （t=3.482）、Chst3 （t=6.949）、Kynu （t=5.399 ）、白细胞介素（IL）-1β （t=2.960）、TNF-α（t=5.800）、IL-6 （t=3.130）、干扰素-γ （t=7.690）、IL-17 （t=6.530）mRNA相对表达量显著下降，差异有统计学意义（P<0.05 ）。结论TAGLN2可能通过NF-κB和Jak-STAT信号通路抑制高糖诱导的小胶质细胞炎症反应；Card11、Icos、Chst3、Kynu在TAGLN2抗炎过程中可能发挥了重要作用。

简介：摘要目的观察661W细胞低氧条件下基因表达水平和信号通路的早期改变，寻找潜在功能性靶基因。方法将培养的小鼠661W细胞分为低氧处理组、常氧对照组。低氧处理组细胞置于37 ℃、体积分数分别为1%、5% CO2的三气培养箱中培养；常氧对照组细胞置于37 ℃、体积分数为5% CO2培养箱中培养。培养4 h后，采用高通量测序技术对两组661W细胞进行转录组测序，筛选显著差异表达基因（DEG ）。对筛选得到的DEG进行聚类热图分析、基因注释（GO）功能富集分析、京都基因与基因组百科全书（KEGG）的信号通路富集分析和蛋白互作网络（PPI）分析。采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）对DEG mRNA表达进行验证。结果共筛选出506个DEG，其中上调基因459个，下调基因47个。GO功能富集分析结果显示，DEG主要富集的生物过程是细胞对低氧反应、糖酵解、细胞增生负调控及凋亡等。KEGG信号通路富集分析结果显示，糖酵解与糖异生、果糖代谢、磷酸戊糖途径以及淀粉和蔗糖代谢等糖代谢途径被显著富集。缺氧诱导因子（HIF）-1α信号通路、糖酵解、FoxO信号通路、胰岛素信号通路和腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）信号通路参与了上述过程。PPI分析结果显示，低氧相关的关键基因是Aldoa、Aldoc、Gpi1、Hk2、Hk1、Pfkl、Pfkp、Vhl、Fbxo10、Fbxo27。RT-PCR检测结果显示，低氧处理组细胞中15个DEG mRNA表达水平均较常氧对照组升高，差异有统计学意义（P<0.05）。N-myc下游调控基因-1（Ndrg1）、Mt1及血管内皮生长因子A（VEGFA） mRNA表达水平有低氧时间依赖性。结论低氧下DEG主要为糖代谢相关基因、细胞对缺氧反应相关基因以及调控增生和凋亡相关基因。HIF-1α信号通路、糖酵解、FoxO信号通路和AMPK信号通路参与了低氧下661W细胞的早期改变。Aldoa、Aldoc、Gpi1、Hk2、Hk1、Pfkl、Pfkp、Vhl、Fbxo10、Fbxo27可能在661W细胞应对低氧反应中起到关键作用。Ndrg1、Mt1及VEGFA可作为研究缺血、缺氧相关眼底疾病的潜在功能性靶基因。