基于液相阻断ELISA检测方法的口蹄疫病毒抗体快速检测方法研究

基于液相阻断ELISA检测方法的口蹄疫病毒抗体快速检测方法研究

徐玉琪

安徽省六安市霍山县畜牧产业发展中心 237200 安徽省六安市

摘要：采用O型液相阻断ELISA免疫抗体检测方法对猪的口蹄疫O型进行监测，本实验共监测猪样本40份，通过4℃冷藏过夜以及37℃温育2小时对猪口蹄疫O型进行监测，检测结果发现在4℃冷藏过夜下口蹄疫O型液相阻断ELISA免疫抗体检测方法的检测合格率是90.0%，在37℃温育2小时下口蹄疫O型液相阻断ELISA免疫抗体检测方法的检测合格率是77.5%，两种方式的检查结果相差12.5%，可以得出在4℃冷藏过夜下口蹄疫O型液相阻断ELISA免疫抗体检测方法比在37℃温育2小时下口蹄疫O型液相阻断ELISA免疫抗体检测方法更高效。

关键词：液相阻断；ELISA；口蹄疫；病毒；检测方法

前言：口蹄疫是广泛存在于偶蹄动物中，由口蹄疫病毒传播的具有传染性的疾病，具有急性、高度接触性传染、热性的特点。目前检测口蹄疫抗体经常使用的方法是液相阻断ELISA免疫抗体检测，这种检测方法有高灵敏性、高特异性、高稳定性的优点，并且检测结果精确，实验操作简单，是现在口蹄疫抗体跟踪监测首选的实验方法。张作秀用液相阻断ELISA免疫抗体检测方法对牛羊O型口蹄疫进行检测，实验结果表明液相阻断ELISA免疫抗体检测方法的准确性很高。吕艳秋发现正向间接血凝抗体检测方法的合格率高于液相阻断ELISA检测方法。朱爱发发现液相阻断ELISA检测方法具有高灵敏度、重复性好等特点，但操作烦琐、成本高，抗体阻断（固相）ELISA检测方法具有成本低、操作简单等优点，缺点是准确度不够，在检测中建议根据检测的具体要求进行选择。以上实验结果还无法对液相阻断ELISA免疫抗体检测方法进行完全的分析，因此本试验采用口蹄疫液相阻断ELISA免疫抗体检测方法对猪血清中的口蹄疫抗体进行检测。

一、材料与方法

（一）检测样品

某牧场猪群均接受口蹄疫O型灭活疫苗免疫2个月后于2023年10月进行猪血清样品的采集，共计40份猪血清样品，不能有溶血状态、受污染、破损、变质样品。

（二）试验器材

酶标仪、吸水纸、超纯水仪、移液器及其配套设施、37℃恒温温箱、移液槽、低速离心机、洗瓶、量筒、微量抗原抗体反应板、4℃冰箱、口蹄疫O型液相阻断ELISA抗体检测试剂盒（真瑞生物）。

二、试验步骤

（一）试剂准备

在实验开始前1小时从冰箱中取出口蹄疫病毒O型抗体液相阻断ELISA检测试剂盒，使试剂盒至常温。打开纯水仪，按照试剂盒的要求对10倍浓缩洗涤液进行稀释。打开37℃恒温温箱（使温度维持在37℃）。

（二）4℃冷藏过夜实验步骤

（1）在稀释板上内按80μL/孔加入样品稀释液，之后将待检样品血清按20μL/孔加入孔内并吹打混匀（移液器枪头不混用）。阴阳性对照血清不需要稀释，直接按100μL/孔加入孔内。（2）轻轻震荡摇匀，盖上封板膜，将稀释板放置于4℃冰箱内静置过夜。（3）将血清抗原全部转移至微量抗原抗体反应板上，放置于37℃恒温温箱温育60分钟。（4）小心揭开封板膜，甩掉板孔中的溶液，使用工作浓度洗涤液每孔加入250μL，之后再甩去溶液，该步骤重复4次，最后用吸水纸吸干水分。（5）每孔加入酶结合物100μL，盖上封板膜，放置于37℃恒温温箱温育60分钟。（6）小心解开封板膜，甩掉孔中溶液，用（4）的方式洗涤4次，同样用吸水纸吸干水分。（7）每孔加入加显色液100μL，混匀、盖上封板膜37℃闭光显色15分钟。（8）每孔加终止液50μL，使反应终止，10分钟内用酶标仪在450nm（630nm作参比波长）读取吸光度OD值。

（三）37℃温育2小时实验步骤

（1）在稀释板上内按80μL/孔加入样品稀释液，之后将待检样品血清按20μL/孔加入孔内并吹打混匀（移液器枪头不混用）。阴阳性对照血清不需要稀释，直接按100μL/孔加入孔内。（2）轻轻震荡摇匀，盖上封板膜，将稀释板放置于37℃恒温温箱内温育2小时。（3）将血清抗原全部转移至微量抗原抗体反应板上，放置于37℃恒温温箱温育60分钟。（4）小心揭开封板膜，甩掉板孔中的溶液，使用工作浓度洗涤液每孔加入250μL，之后再甩去溶液，该步骤重复4次，最后用吸水纸吸干水分。（5）每孔加入酶结合物100μL，盖上封板膜，放置于37℃恒温温箱温育60分钟。（6）小心解开封板膜，甩掉孔中溶液，用（4）的方式洗涤4次，同样用吸水纸吸干水分。（7）每孔加入加显色液100μL，混匀、盖上封板膜37℃闭光显色15分钟。（8）每孔加终止液50μL，使反应终止，10分钟内用酶标仪在450nm（630nm作参比波长）读取吸光度OD值。

三、实验结果

（一）4℃冷藏过夜实验结果

在40份检测样品中口蹄疫O型抗体除A5、A7、A11、A29外其余检测样品均为阳性，该项数据证明4℃冷藏过夜对口蹄疫O型抗体的检测准确性较高。

（二）37℃温育2小时实验结果

在40份检测样品中口蹄疫O型抗体除A5、A7、A11、A13、A17、A19、A23、A29、A37外其余检测样品均为阳性，与4℃冷藏过夜实验结果相比，该方法的准确性较低。

（三）口蹄疫O型抗体合格率

4℃冷藏过夜口蹄疫O型抗体检测合格率为90.0%，37℃温育2小时口蹄疫O型抗体检测结果合格率为77.5%，两种方法比较合格率相差12.5%，如表1。

表1口蹄疫O型抗体检测结果

四、结果分析

有研究学者发现液相阻断ELISA免疫抗体检测方法具有高灵敏性、高特异性和高稳定性，能快速、高效、准确地监测抗体。麦尼沙姑丽·艾山通过液相阻断ELISA免疫抗体检测方法检测了经口蹄疫O型灭活疫苗免疫的1200头奶牛血清样品，结果发现1200份被检样品，合格率为98.17%；认为液相阻断ELISA免疫抗体检测方法值得推广。

本实验结果如表1，样品A5、A7、A11、A29在4℃冷藏过夜实验组和37℃温育2小时实验组均为阴性，样品A13、A17、A19、A23、A37这五组在4℃冷藏过夜实验组表现为阳性，在37℃温育2小时实验组表现为阴性，4℃冷藏过夜实验组的合格率为90.0%，37℃温育2小时实验组的合格率为77.5%，合格率相差12.5%，以上数据说明4℃冷藏过夜检测的准确性高于37℃温育2小时。

五、结语

口蹄疫液相阻断ELISA免疫抗体检测方法经常被用于检测猪、牛和羊血清中的口蹄疫病毒抗体，该方法具有较高的敏感性和快速性，能够精准地对口蹄疫进行检测，是猪、牛和羊等家禽口蹄疫免疫抗体检测的首选检测方法。本实验结果发现在4℃冷藏过夜条件下口蹄疫O型液相阻断ELISA抗体监测试剂盒的实验结果更为准确，但实验时间较长，实验时间一般为16小时以上，与4℃冷藏过夜实验相比在37℃温育2小时条件下口蹄疫O型液相阻断ELISA抗体监测试剂盒的实验结果准确度偏低，但实验时间较短，实验时间一般为4小时左右。结合以上结果，在进行口蹄疫O型检测时，我们可以根据对口蹄疫O型检测结果的需求来进行不同的实验测定方法，在时间充裕或者更注重实验准确度的前提下我们可以采用4℃冷藏过夜的实验方法，以保证实验的精准性，在急需知道口蹄疫O型检测结果或者不看重检测准确度的前提下推荐采用37℃温育2小时的实验方法，更快捷，以便于更快知道实验检测结果。

参考文献：

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