不同浓度胎牛血清和新生牛血清对人二倍体细胞（2BS株）培养的影响

不同浓度胎牛血清和新生牛血清对人二倍体细胞（2BS株）培养的影响

付佳悦，杜立强，史晓莉，杨小飞，李艳霞【通信作者】

北京生物制品研究所有限责任公司 100176

摘要:目的研究胎牛血清和新生牛血清在不同浓度条件下，对人二倍体细胞生长影响的情况，确定更适合人二倍体细胞生长的血清类型、浓度以及生长天数。方法进行预试验，选取同一厂家的胎牛血清和新生牛血清，分别制备含1%、2%、5%、10%血清浓度的细胞生长液，在T75方瓶中进行人二倍体细胞培养，分别在第1天、第3天、第4天、第5天、第6天、第7天观察细胞上清液，显微镜下观察细胞形态、贴壁情况，并用胰酶消化细胞，通过全自动细胞计数仪测定T75方瓶中的活细胞浓度、细胞存活率。根据预试验结论调整浓度范围，制备合适血清浓度的细胞生长液以及确定合适细胞生长天数，在T75方瓶中进行人二倍体细胞培养，并进行观察与测定。结果胎牛和新生牛血清无显著差异，血清浓度在10%时效果最好，培养至第4-5天时细胞活率达到峰值；胎牛血清浓度为5%时，培养效果可以达到新生牛血清5%更高浓度的培养效果，经验证其准确性和可重复性均良好。结论在浓度相同的情况下，新生牛血清与胎牛血清在培养人二倍体细胞时，培养效果无显著差异，而低浓度（5%）的胎牛血清与高浓度新生牛血清培养效果无明显差异，从细胞生长情况、培养效果和经济角度选择低浓度胎牛血清替换高浓度新生牛血清培养人二倍体细胞更为适合。

关键词:人二倍体细胞；新生牛血清；胎牛血清；细胞浓度；细胞活率

牛血清在生物医药领域被公认为重要原材料，是细胞培养中用量较大的天然培养基，含有丰富的细胞生长必需的营养成分，在细胞的代谢、增殖与分化中发挥重要的调节作用，常用于动物细胞的体外培养［1-2］。在培养基中加入适量的牛血清，不仅可以有效促进细胞的生长繁殖，还能够缩短细胞的生长周期，从而加快疫苗的生产，提高疫苗的产量，为疫苗生产企业带来更多的利益[3]。

在我国使用最多的牛血清是胎牛血清和新生牛血清，胎牛血清是从屠宰怀孕母牛（八月龄胎）时通过心脏穿刺采血，分离血清，经滤过除菌制成，是疫苗生产的重要原辅料之一[4-6]，是细胞培养中效果最好的天然培养基，可提供细胞贴壁、铺展在塑料培养基质上所需因子，还能发挥酸碱缓冲液作用[6、7]。而新生牛血清是从出生12-24 h的新生牛静脉采血取得［4］，采集出生时间小于24h的健康牛犊的血清，它是细胞培养中用量最大的天然培养基，含有血小板促生长因子、成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子等，在可获得较好的细胞生长增殖效果[6]。因而，两者所含的促细胞生长因子、激素及其他活性物质组分与比例存在差异［4］。

由此可见，牛血清在用于疫苗生产中的细胞培养阶段是非常重要的原材料，但牛血清使用量大且价格较贵，其中进口胎牛血清更是价格高昂。所以，从细胞培养的效果和降低生产成本两个方面综合考虑，在开展具体工作前挑选符合生产要求且使用量小、价格便宜的牛血清是必要的。

1材料与仪器

1.1人二倍体细胞人二倍体细胞（2BS）由北京生物制品研究所有限责任公司提供，疫苗研究一室自行制备。

1.2主要试剂及仪器新生牛血清（500 mL/瓶），胎牛血清（500 mL/瓶）购自浙江天杭生物科技股份有限公司；胰蛋白酶购自美国GIBCO公司；水解乳蛋白粉剂购自美国BD公司；MEM粉剂购自美国GIBCO公司；0.25%胰蛋白酶溶液，水解乳蛋白MEM液为北京生物自配培养液。显微镜，重庆光学仪器厂；全自动细胞计数仪，北京赛泰克IC1000。

2预试验方法与结果分析

2.1预试验方法配制新生牛血清和胎牛血清浓度分别为1%、2%、5%、10%的人二倍体细胞生长液，用于30代的人二倍体细胞在T75方瓶中恒温培养。28代人二倍体细胞经37℃培养4天，呈致密单层，将T75表面消毒后，开启，弃旧液，加入0.25%胰酶消化细胞，待细胞表面呈毛玻璃样时，弃胰酶，加入细胞生长液，吹打分散，按1：4比例分种细胞于T75方瓶中，再加入不同血清浓度的细胞生长液，放置37℃培养。分别在第1天、第3天、第4天、第5天、第6天、第7天取一组细胞观察其细胞上清液，显微镜下观察细胞形态、贴壁情况，然后用0.25%胰酶进行消化，制成细胞悬液，通过全自动细胞计数仪对细胞悬液进行测定，记录细胞的活细胞数、细胞活率。

2.2预试验结果

2.2.1 2BS细胞生长情况观察及细胞计数结果比较

2.2.1.1细胞生长状态用显微镜观察细胞形态，除胎牛1%血清浓度的细胞脱落外，其余细胞均生长良好，传代后4d长成致密单层，无悬浮死细胞，贴壁良好；显微镜下均为典型的成纤维细胞，呈长梭型，边缘清晰，轮廓清楚。

X10%1dX10%3dX10%5d

T10%1dT10%3dT10%5d

2.2.1.2细胞计数结果比较

2.2.1.2.1对计数结果取均值制作不同浓度胎牛血清和新生牛血清培养的2BS细胞生长曲线，如图1、2所示，除胎牛1%血清浓度的细胞脱落外，其余7组细胞均在传代后5d生长密度接近峰值，生长液血清浓度为10%时细胞计数结果最高。

2.2.1.2.2对计数结果取均值制作不同浓度胎牛血清和新生牛血清的2BS细胞生长曲线，如图3-6所示。除生长液血清浓度为1% 的细胞，因部分脱落无法比较结果外，其余三组细胞计数结果显示，胎牛血清较新生牛血清培养的细胞生长速度快，且活细胞数高于新生牛血清培养的细胞。

2.2.2活率的影响根据测定的细胞活率绘制胎牛与新生牛血清培养的细胞细胞活率曲线图。如图7、8所示，细胞活率逐渐下降，第5d后下降明显。

表1.不同浓度胎牛血清和新生牛血清培养的人二倍体细胞细胞活率

2.3统计学分析

2.3.1相同浓度的胎牛血清与新生牛血清培养的人二倍体细胞细胞计数使用相同浓度的胎牛血清和新生牛血清在人二倍体细胞培养过程中无显著性差异。

表2.相同浓度胎牛血清和新生牛血清培养的人二倍体细胞细胞计数统计表

2.3.2不同浓度胎牛血清和新生牛血清培养的人二倍体细胞细胞计数使用不同浓度的胎牛血清和新生牛血清在人二倍体细胞培养过程中无显著差异。

表3.不同浓度胎牛血清和新生牛血清培养的人二倍体细胞细胞计数统计表

3试验方法与结果分析

3.1试验方法根据预试验结果，分别配制新生牛血清和胎牛血清含量分别为5%、8%、10%、12%的细胞生长液，用于28代的人二倍体细胞在T75方瓶中恒温培养。26代人二倍体细胞经37℃培养4天，呈致密单层，将T75表面消毒后，开启，弃旧液，加入0.25%胰酶消化细胞，待细胞表面呈毛玻璃样时，弃胰酶，加入细胞生长液，吹打分散，按1：4比例分种细胞于T75方瓶中，再加入不同血清浓度的细胞生长液，放置37℃培养。分别在第2天、第4天、第6天、第8天取一组细胞观察其细胞上清液，显微镜下观察细胞形态、贴壁情况，然后用0.25%胰酶进行消化，制成细胞悬液，通过全自动细胞计数仪对细胞悬液进行测定，记录细胞的总细胞数、细胞活率。

3.2试验结果

3.2.1 2BS细胞生长情况观察及细胞计数曲线

3.2.1.1细胞生长状态用显微镜观察细胞形态，细胞均生长良好，传代后4d长成致密单层，无悬浮死细胞，贴壁良好；显微镜下均为典型的成纤维细胞，呈长梭型，边缘清晰，轮廓清楚。                           

X10%4d                     X10%6d

                    T10%4d                     T10%6d

3.2.1.2细胞计数

3.2.1.2.1对计数结果取均值制作不同浓度胎牛血清和新生牛血清的2BS活细胞生长曲线，如图9、10所示，8组细胞均在传代后6d生长密度接近峰值，生长液血清浓度为10%时细胞计数结果最高。

2.2.1.2.2对计数结果取均值制作不同浓度胎牛血清和新生牛血清的2BS活细胞生长曲线，如图11-14所示，胎牛血清较新生牛血清培养细胞数无明显差别，胎牛血清较新生牛血清培养的细胞生长速度快。

3.2.2活率的影响根据测定的细胞活率绘制胎牛与新生牛血清的细胞活率曲线图。如图15、16所示，细胞活率逐渐下降，在第4d后下降明显。

表4.不同浓度胎牛血清和新生牛血清培养的人二倍体细胞细胞活率

3.3统计学分析

3.3.1相同浓度的胎牛血清与新生牛血清培养的人二倍体细胞细胞计数使用相同浓度的胎牛血清和新生牛血清在人二倍体细胞培养过程中无显著性差异。

表5.相同浓度胎牛血清和新生牛血清培养的人二倍体细胞细胞计数统计表

2.3.2不同浓度胎牛血清和新生牛血清培养的人二倍体细胞细胞计数使用不同浓度的胎牛血清和新生牛血清在人二倍体细胞培养过程中无显著差异。

表6.不同浓度胎牛血清和新生牛血清培养的人二倍体细胞细胞计数统计表

4.讨论

根据预实验及实验结果，培养人二倍体细胞时，任何一种血清都可以满足要求，胎牛血清较新生牛血清培养细胞生长速度更快，更适合于生产大批量的人二倍体细胞使用。并且胎牛血清绝大部分的物质来自于母体，含有胚胎发育过程中必须的生长因子和激素等，而新生牛血清中这种生长因子和激素含量则减少，含有一些离开母体后自身产生的代谢物质，对于一些培养难度大以及对培养环境要求苛刻的细胞，胎牛血清的培养效果更好。

通过实验数据对比结果可知，添加低浓度胎牛血清的条件下与添加高浓度新生牛血清的条件下培养出的人二倍体细胞统计学无显著差异，即可使用低浓度胎牛血清达到高浓度新生牛血清培养效果，降低了牛血清的使用量，从而达到降低制品牛血清白蛋白残留量，减少制品致敏源，提高制品质量的效果。同时使用低浓度牛血清减少了牛血清的使用量，可以有效减少低温原材料库储存压力，降低仓储管理运行成本。

参考文献

[1] 宋红英, 高丽美, 顾春燕, 等. 牛血清蛋白含量的高低对细胞生长的影响［J］. 浙江省医学科学院学报, 2005, 16(3): 37-8.

[2] 章静波, 徐存拴, 陈实平. 动物细胞培养基本技术指南［M］. 北京: 北京科学出版社, 2005: 112-6.

[3]王明惠,张敬武.牛血清在疫苗生产中的质量控制措施[J].中国卫生产业,2018,15(09):139-140.DOI:10.16659/j.cnki.1672-5654.2018.09.139.

[4]李彩霞,王福科,刘流.超高效液相色谱-质谱联用技术分析新生牛和胎牛血清组分[J].南方医科大学学报,2014,34(05):751-753.

[5] 王祎,杨磊,王海东,等.不同浓度血清对肝细胞原代培养的影响[J].农业技术与装备,2009,(3):42-43.

[6]石嘉琛,王家敏,乔自林.动物血清的成分及在细胞培养中的作用[J].甘肃畜牧兽医,2020,50(10):12-14+19.DOI:10.15979/j.cnki.cn62-1064/s.2020.10.002.

[7] 李华,徐琼芳,段维国,等.牛血清在疫苗生产中的质量控制[J].云南医药,2006，(4):321-323.

[8]吴宏梅,刘帅,包阿东,陆涛峰,刘长青,张文秀,关伟军,马月辉.不同胎牛血清对动物细胞体外培养的影响[J].中国畜牧兽医,2009,36(04):96-99.

[9]付永其,金珏艳,张颖欣,刘辉,陆晨,宋艳梅,杨琦,陆梦溪,王为.新生牛血清的质量控制对SPF鸡胚细胞和人二倍体(2BS)细胞生长的影响[J].中国生物制品学杂志,2018,31(11):1182-1187+1191.DOI:10.13200/j.cnki.cjb.002354.

[10]孙招金,陈霄云,王玲,叶贺佳. 不同新生牛血清对动物细胞体外培养的影响[C]//.中国畜牧兽医学会生物制品学分会中国微生物学会兽医微生物学专业委员会2010年学术年会（第三届中国兽药大会学术论坛）论文集.[出版者不详],2010:373-375.

[11]金亦宏,马欣,周莉薇.国产牛血清的现状[J].中国生物制品学杂志,2004(04):254-256.DOI:10.13200/j.cjb.2004.04.62.jinyh.022.

[12]董关木.细胞培养用牛血清现状与进展[J].中国生物制品学杂志,2007(09):697-700.DOI:10.13200/j.cjb.2007.09.70.donggm.022.

[13]乔自林,冯玉萍,李明生,冯若飞,马祺,富小刚,马忠仁.我国新生牛血清的生产现状[J].西北民族大学学报(自然科学版),2009,30(04):43-45.DOI:10.14084/j.cnki.cn62-1188/n.2009.04.005.

[14]王伟.不同生长时期牛血清对细胞培养效果的影响[J].中兽医学杂志,2015(10):6-7.

[15]马桂兰,暴艳敏,徐水林,孔来信,王家敏,马忠仁,乔自林.胎牛血清和新生牛血清体外培养动物细胞的效果比较[J].黑龙江农业科学,2014(02):65-68.

[16]张宏丽,任琦,夏青娟,李春雷,杨利民,徐艳玲.低血清培养基培养人胚肺二倍体细胞(2BS株)及其增殖甲型肝炎病毒的初步研究[J].微生物学免疫学进展,2021,49(06):13-17.DOI:10.13309/j.cnki.pmi.2021.06.003.
通信作者：李艳霞*

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