宿迁市食品药品检验所,江苏 宿迁 223800
[摘 要]目的 建立同时测定妇月康胶囊中阿魏酸、丹皮酚和甘草酸铵3种成分含量的HPLC法。方法 采用Agilent TC-C18色谱柱 (150mm×4.6mm, 5μm);以乙腈-0.4%磷酸溶液为流动相进行梯度洗脱,流速为1.0mL·min-1 ,柱温为35℃,检测波长为254nm。结果 阿魏酸、丹皮酚和甘草酸铵分别在4.05~162μg∙ml-1,3.968~158.72μg∙ml-1和2.764~110.56μg∙ml-1范围内与峰面积呈良好的线性关系,平均回收率分别为98.86%、98.59%、99.00%,RSD值分别为1.14%、1.17%、0.71%。结论 该方法稳定性高,重复性好,灵敏性强,结果准确,可用于妇月康胶囊的质量控制。
[关键词]HPLC;妇月康胶囊;阿魏酸;丹皮酚;甘草酸铵
Simultaneous Determination of Three Constituents in Fuyuekang Capsules by HPLC
Chen Juan, Hu Sheng-jun, Zhu Yu
(Suqian Food and Drug Inspection Institute, Jiangsu Suqian 223800, China)
[ABSTRACT] OBJECTIVE To establish an HPLC method for the simultaneous determination of three constituents including Ferulic acid, paeonol and ammonium glycyrrhetate in Fuyuekang capsules. METHODS The Agilent TC-C18 Column (150mm×4.6mm, 5μm) was used. The mobile phase was acetonitrile-0.4% phosphoric acid solution for gradient elution, the flow rate was 1.0 mL·min-1, the column temperature was 35°C, and the detection wavelength was 254nm. RESULTS Ferulic acid, falpopanol and ammonium glycyrrhizinate showed good linear relationships with the peak area in the ranges of 4.05~162μg∙ml-1, 3.968~158.72μg∙ml-1 and 2.764~110.56μg∙ml-1, with average recoveries of 98.86%, 98.59% and 99.00%, and RSD values of 1.14%, 1.17% and 0.71%, respectively. CONCLUSION This method has high stability, good repeatability, strong sensitivity, and accurate results, and can be used for the quality control of Fuyuekang capsules.
[KEYWORDS] HPLC; Fuyuekang capsules; Ferulic acid; Paeonol; Ammonium glycyrrhizinate
作者简介:陈娟(1996-),女,江西南昌,药师,硕士,研究方向为中药与天然药化。E-mail:1255892521@qq.com
妇月康胶囊由当归、川芎、益母草、桃仁、红花、徐长卿、干姜(炭)和甘草(炙)八味中药组成,具有活血、祛瘀、止痛功效,临床主治产后恶露不行,少腹疼痛,也可试用于上节育环后引起的阴道流血,月经过多[1]。近年来,药物流产因简便、有效、无创伤,避免宫腔手术操作及并发症,在临床上广泛应用,但药物流产后阴道出血时间长、出血量多及并发症多有发生[2-3]。有文献报道[4-6]妇月康胶囊作为药物流产的辅助用药,完全流产率高,出血时间明显缩短,出血量明显减少,能取得满意效果。从药味和疗效分析,处方中当归为君药,可补血活血,调经止痛,润肠通便;川芎为臣药,能活血行气,祛风止痛;二者的有效成分阿魏酸,具有抗血小板凝集、抗血栓和抗菌消炎功能[7]。徐长卿为佐药,可祛风,化湿,止痛,止痒;丹皮酚作为其主要活性成分,具有抗动脉粥样硬化、改善微循环和保护缺血组织作用
[8]。炙甘草为佐药,能补脾和胃,益气复脉,其有效成分甘草酸铵在一定程度上具有抗炎和抗纤维化的药理作用[9-10]。妇月康胶囊现行质量标准[1]为《卫生部药品标准》中药成方制剂第十七册,检验项目仅包含一项化学反应和阿魏酸薄层鉴别;现有文献[11 -14]仅测定处方中单一成分的含量且该处方中徐长卿的丹皮酚含量测定方法暂无报道,不能全面评价制剂的内在质量,难以确保临床用药安全性和有效性。因此,为了从多角度评价和控制妇月康胶囊的质量,本实验采用HPLC法同时检测妇月康胶囊中4味药材(当归、川芎、徐长卿和甘草(炙))的3个成分(阿魏酸、丹皮酚和甘草酸铵)的含量并进行方法学验证。
1.仪器与试药
KH-300DE型数控超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司);Ultimate 3000型高效液相色谱仪(美国赛默飞);XS205电子天平(瑞士梅特勒公司); HH-4数显恒温水浴锅(金坛市华峰仪器有限公司);0.45μm微孔滤膜(江苏麦斯韦特科技有限公司)。
对照品:阿魏酸(批号:110773-201915,供含量测定用)、丹皮酚(批号:110708-201908,供含量测定用)、甘草酸铵(批号:110731-202122,供含量测定用),均购自中国食品药品检定研究院;妇月康胶囊(批号2203030,2201010和2203022,湖北广仁药业有限公司)均为市售品;乙腈(色谱纯,美国Tedia)、甲醇(色谱纯,德国默克),水为重蒸水,其他试剂为分析醇。
2.色谱条件
色谱柱:Agilent TC-C18柱 (150mm×4.6mm, 5μm);流速1ml∙min-1;流动相:乙腈(a)-0.4%磷酸溶液(b)梯度洗脱(0~15min, 13%a; 15~20min, 13%→25%a; 20~40min, 25%→40%a);检测波长:245nm;柱温:35℃;进样量:10μl。
3.溶液的配制
3.1对照品溶液的配制
精密称取阿魏酸20.25mg、丹皮酚19.84mg和甘草酸铵13.82mg,置于50ml量瓶中,加50%甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,制成混合对照品储备液。精密量取1ml,置于10ml量瓶中,加50%甲醇稀释至刻度,摇匀,上清液用微孔滤膜(0.45μm)滤过,取续滤液,即得。
3.2供试品溶液的配制
称取样品2.4g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入50%甲醇25ml,称定重量,超声处理30min,取出,放冷,再称定重量,用50%甲醇补足减失重量,摇匀,上清液用微孔滤膜(0.45μm)滤过,取续滤液,即得。
3.3阴性对照溶液的配制
按样品的处方及制备工艺制备分别缺当归和川芎、徐长卿、甘草(炙)的阴性样品,取适量按“3.2”项下方法操作,即得阴性对照溶液。
4.系统适用性试验
依次精密吸取对照品、供试品溶液和阴性对照溶液10μl,注入高效液相色谱仪中,记录色谱图,见图1。结果显示,阿魏酸、丹皮酚、甘草酸铵色谱峰的分离度均大于2.0,理论板数均大于4500,供试品与对照品色谱相应的位置上均出现保留时间相同的色谱峰,而阴性对照与对照品色谱相应的位置上未出现保留时间相同的色谱峰,表明妇月康胶囊其他成分对阿魏酸、丹皮酚、甘草酸铵的测定无干扰。
注:A.对照品溶液;B.供试品溶液;C.当归和川芎阴性对照溶液;D.徐长卿阴性对照溶液;C.甘草(炙)阴性对照溶液;1.阿魏酸;2.丹皮酚;3.甘草酸铵
图1高效液相色谱图
4.1线性关系实验
依次精密量取“3.1”项下的混合对照品储备液2ml,,分别置5、10、20、50、100、200ml量瓶中,加50%甲醇稀释至刻度,摇匀。分别吸取上述溶液10μl注入液相色谱仪,记录测定峰峰面积,以峰面积y(mAU*s)为纵坐标、进样浓度x (μg∙ml-1)为横坐标,进行线性回归,得出阿魏酸回归方程为: y = 15.84445x-45.81389 (r=0.9995, n=6),阿魏酸的质量浓度在4.05~162μg∙ml-1范围内浓度与峰面积有良好的线性关系;丹皮酚回归方程为: y = 3.43036x-0.98095 (r=0.9996, n=6),丹皮酚的质量浓度在3.968~158.72μg∙ml-1范围内浓度与峰面积有良好的线性关系;甘草酸铵回归方程为: y = 3.59854x-12.03213 (r=0.9994,n=6),甘草酸铵的质量浓度在2.764~110.56μg∙ml-1范围内浓度与峰面积有良好的线性关系。
4.2精密度实验
精密吸取对照品溶液重复进样6次,记录各自的峰面积,结果阿魏酸、丹皮酚和甘草酸铵峰面积的RSD值分别为0.35%、0.36%和0.35%(n=6)。表明仪器的精密度良好。
4.3重复性实验
称取同一样品(批号2203022)按照“3.2”项下方法制备6份供试液溶液,按照“2.”项下色谱条件进样,分别测定阿魏酸、丹皮酚和甘草酸铵的峰面积,以峰面积与质量之比计算含量,结果6份RSD值均小于1.0%(n=6)。表明本方法重复性良好。
4.4稳定性实验
取“3.2”项下的供试品溶液(批号2203022),在0、2、4、8、12、24h分别进样,记录各自的峰面积,计算得阿魏酸、丹皮酚和甘草酸铵峰面积RSD值分别为1.17%、0.66%和0.83%(n=6)。表明供试品溶液在24h内稳定性良好。
4.5加样回收实验
依次精密量取混合对照品储备液3.0、6.0和8.0ml,分别置100ml量瓶中,用50%甲醇稀释至刻度,摇匀,得到对照品溶液①、②和③;再精密称取同一样品(批号2203022)1.2g,9份,置具塞锥形瓶中,分别精密加入对照品溶液①、②和③25ml,平行三份,按3.2项下方法制备供试品溶液,分别进样测定峰面积,计算得阿魏酸、丹皮酚和甘草酸铵平均回收率分别为98.86%、98.59%、99.00%,RSD值分别为1.14%、1.17%、0.71%(n=9)。表明该方法准确度较好,结果见表1。
表1 妇月康胶囊中3种成分的加样回收试验(n=9)
成分 | 取样量(g) | 样品含量(mg) | 加入量(mg) | 测定量(mg) | 回收率(%) | 平均回收率(%) | RSD(%) |
阿 魏 酸 | 1.2196 | 0.6032 | 0.3038 | 0.9065 | 99.83 | 98.86 | 1.14 |
1.2227 | 0.6047 | 0.3038 | 0.9037 | 98.40 | |||
1.2136 | 0.6002 | 0.3038 | 0.9011 | 99.03 | |||
1.222 | 0.6045 | 0.6075 | 1.2066 | 99.12 | |||
1.2112 | 0.5991 | 0.6075 | 1.2105 | 100.65 | |||
1.2188 | 0.6028 | 0.6075 | 1.2089 | 99.77 | |||
1.2189 | 0.6029 | 0.81 | 1.3929 | 97.53 | |||
1.2271 | 0.6069 | 0.81 | 1.4013 | 98.07 | |||
1.2306 | 0.6087 | 0.81 | 1.3968 | 97.30 | |||
丹 皮 酚 | 1.2196 | 0.5343 | 0.2976 | 0.8299 | 99.33 | 98.59 | 1.17 |
1.2227 | 0.5357 | 0.2976 | 0.8275 | 98.06 | |||
1.2136 | 0.5317 | 0.2976 | 0.8286 | 99.77 | |||
1.222 | 0.5354 | 0.5952 | 1.1141 | 97.23 | |||
1.2112 | 0.5306 | 0.5952 | 1.1298 | 100.67 | |||
1.2188 | 0.5340 | 0.5952 | 1.1224 | 98.86 | |||
1.2189 | 0.5340 | 0.7936 | 1.3117 | 98.00 | |||
1.2271 | 0.5376 | 0.7936 | 1.3109 | 97.44 | |||
1.2306 | 0.5391 | 0.7936 | 1.3162 | 97.92 | |||
甘 草 酸 铵 | 1.2196 | 0.3780 | 0.2073 | 0.5835 | 99.15 | 99.00 | 0.71 |
1.2227 | 0.3789 | 0.2073 | 0.5817 | 97.82 | |||
1.2136 | 0.3761 | 0.2073 | 0.5813 | 98.99 | |||
1.222 | 0.3787 | 0.4146 | 0.7897 | 99.12 | |||
1.2112 | 0.3754 | 0.4146 | 0.7902 | 100.06 | |||
1.2188 | 0.3777 | 0.4146 | 0.7846 | 98.14 | |||
1.2189 | 0.3777 | 0.5528 | 0.9286 | 99.65 | |||
1.2271 | 0.3803 | 0.5528 | 0.9259 | 98.70 | |||
1.2306 | 0.3814 | 0.5528 | 0.9304 | 99.32 |
5样品含量测定
称取3批样品2.4g,精密称定,按照3.2项下方法制备供试液,取10µl,注入高效液相色谱仪中,记录色谱峰面积,计算的含量结果见表2。
表2 样品中阿魏酸、丹皮酚和甘草酸铵的含量
样品批号 | 平均粒重(g) | 取样量(g) | 阿魏酸含量(mg/粒) | 丹皮酚含量(mg/粒) | 甘草酸铵含量(mg/粒) |
2203030 | 0.4102 | 2.4426 | 0.1993 | 0.1795 | 0.1273 |
2201010 | 0.3948 | 2.4023 | 0.1852 | 0.1842 | 0.0887 |
2203022 | 0.4065 | 2.4237 | 0.2010 | 0.1781 | 0.1260 |
6.讨论
6.1提取条件选择
在实验过程中,对样品的提取溶剂进行考察,发现与30%甲醇、70%甲醇、纯甲醇、50%乙醇和纯乙醇条件相比,50%甲醇条件下提取的样品最充分,含量最高。对样品分别进行超声提取(10、20、30、40、50min)和加热回流(10、20、30、40、50min)提取,发现30min及以上,两种方式提取的样品含量最高且结果无较大区别,故采取简单、节能的超声提取30min。
6.2流动相选择
本研究比较了甲醇-不同浓度磷酸溶液、乙腈-不同浓度磷酸溶液流动相对实验的影响,发现在甲醇-磷酸溶液体系中,阿魏酸组分峰形变宽、易拖尾,而在乙腈-0.4%磷酸溶液流动相下进行梯度洗脱,3个组分的峰形较好、分离度均较高。
6.3检测波长的选择
用紫外可见吸收检测器在190~400nm范围内对3个组分进行光谱扫描,发现当设定检测波长为254nm时,色谱图杂质干扰小,基线平稳,且阿魏酸、丹皮酚、甘草酸铵均有较好的吸收。
7.结论
中医药主要特点是整体观念,辩证论治,且中药或中成药各成分之间讲究配伍联合作用,单一成分的研究难以揭示中药或中成药的质量和疗效规律,因此对中药及中成药进行多成分的质量控制是目前国际上广泛认可的中药质量评价模式
[15]。本研究建立了采用HPLC法同时检测妇月康胶囊中阿魏酸、丹皮酚和甘草酸铵3个成分的含量分析方法,建立的测定方法经方法学验证符合定量分析要求。该方法稳定性高,重复性好,灵敏性强,结果准确,可用于妇月康胶囊的质量控制。
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作者简介:陈娟(1996-),女,江西南昌,药师,硕士,研究方向为中药与天然药化。E-mail:1255892521@qq.com