无创DNA检测在高龄孕妇产前诊断中的应用分析Application analysis of non-invasional DNA testing in prenatal diagnosis in elderly pregnant women

无创DNA检测在高龄孕妇产前诊断中的应用分析Application analysis of non-invasional DNA testing in prenatal diagnosis in elderly pregnant women

彭晓鹰 李爱红

复旦大学附属闵行医院(上海市闵行区中心医院) 上海 201100

【摘要】目的：探究无创DNA产前检测（non-invasive prenatal testing，NIPT)在高龄孕妇胎儿非整倍体染色体疾病产前诊断中的临床应用价值，为高龄孕妇进行无创DNA临床应用提供依据。方法：收集2018年1月至2022年10月在我院自愿进行无创DNA产前检测的单胎高龄孕妇1183例，按年龄将孕妇分为35-39岁组(n=1100)与年龄≥40岁组(n=83)。采用NIPT高通量测序检测孕妇外周血中胎儿游离DNA。检测结果提示染色体高风险者行羊膜腔穿刺抽取羊水进行胎儿染色体核型分析。对检测结果提示低风险者通过电话随访进行验证。观察其胎儿染色体非整倍体疾病诊断。结果：1183例受检者NIPT检测结果提示，胎儿非整倍体染色体异常者12例，其中，21-三体5例，18-三体2例，13-三体1例，性染色体异常4例（2例47，XXX/XXY；1例47，XYY；1例45，XO）。NIPT检测在高龄孕妇中阳性率为1.01%(12/1183)。12例高风险孕妇其中自然流产1例，其余11例均做羊水穿刺，5例21-三体高风险均经羊水穿刺确诊，21-三体在高龄孕妇中的阳性预测值达到100%(5/5)，18-三体在高龄孕妇中的阳性预测值为50%(1/2)，1例13-三体经羊水穿刺排除，性染色体阳性预测值为50%(2/4)。35～39岁年龄组染色体异常高风险发生率为0.73%(8/1100)，年龄≥40岁组染色体异常高风险发生率为4.82%（4/83），两组比较，差异有统计学意义(P＜0.05﹚。结论：NIPT检测对高龄孕妇胎儿 21-三体、18-三体及性染色体符合率较高，可明显减少高龄孕妇介入性产前诊断，但对 13- 三体和性染色体数目减少的符合率偏低，NIPT检测异常的孕妇仍需行羊水穿刺确诊，避免不必要的流产。

【关键词】：无创DNA；染色体核型分析；高龄孕妇；产前诊断

Application analysis of non-invasional DNA testing in prenatal diagnosis in elderly pregnant women.Peng XiaoYing Li Ai Hong ( Minhang Hospital,Fudan University)

Objective: To explore the non-invasive prenatal testing, of non-invasive DNA prenatal testing NIPT) Clinical value in prenatal diagnosis of fetal aneuploidy chromosome disease in elderly pregnant women, For the elderly pregnant women for non-invasive DNA clinical application to provide the basis. Methods: From January 2018 to October 2022,1183 cases of single-born elderly pregnant women with non-invasive DNA prenatal test were collected, Pregnant women were pided into 35-39 years old group (n=1100) and 40 years old group (n=83). High NIPT adoption Flux sequencing for fetal free DNA. in peripheral blood of pregnant women The results showed that amniotic fluid was extracted by amniotic cavity puncture for fetal karyotype analysis. The results showed that the low risk patients were verified by telephone follow-up. To observe the diagnosis of fetal chromosomal aneuploidy. Result :1183 cases NIPT test result indicated, In 12 cases of fetal aneuploidy, Among them, 21-5 trisomy cases, 18- trisomy 2, 13-Trisomy 1 case, 4 cases (2 cases (47 cases) with abnormal sex chromosomes, XXX/XXY; 1 case 47, XYY; 1 case 45, XO). N IPT positive rate was 1.01%(12/1183). Of the 12 high-risk pregnant women ,1 had spontaneous abortion, Amniotic fluid puncture, Five cases of 21-trisomy high risk were confirmed by amniotic fluid puncture, The positive predictive value of 21-tris in older pregnant women was 100%(5/5), The positive predictive value of 18-tris in older pregnant women was 50%(1/2), A case of 13- trisomy was excluded by amniotic fluid puncture, The positive predictive value of sex chromosome was 50%(2/4). A high risk of chromosomal abnormalities in the 35~39 age group was 0.73%(8/110). The 0), the incidence of high risk of chromosomal abnormalities in the 40 year old group ≥4.82%(4/83), and the difference between the two groups was statistically significant (P<0.05). Conclusion: The coincidence rate of NIPT detection on 21-trisomy ,18-trisomy and sex chromosome is high, which can obviously reduce the interventional prenatal diagnosis of elderly pregnant women, but the coincidence rate of 13-trisomy and sex chromosome reduction is low. NIPT pregnant women with abnormal detection still need amniotic fluid puncture diagnosis to avoid unnecessary abortion.

随着国家二胎、三胎政策的放开，高龄产妇日益增多，高龄产妇不仅妊娠并发症风险高，胎儿出生缺陷的风险也大，而出生缺陷的主要原因是染色体异常[1] 。有数据统计提示缺陷儿的出生率为活产儿的3%，全世界每年约有500万婴儿出生时伴有缺陷，平均5-6分钟即有一名出生，其中85%发生在发展中国家[2]。我国先天缺陷儿总数为80-120万，占我国出生人口总数的4%。为出生缺陷的高发国，据统计，每2000万个新生儿中，先天致愚致残缺陷儿占出生总数的4% ～6%。这些患染色体疾病的宝宝先天智力低下、生长发育迟缓、容貌特殊、手脚畸形、有些还伴有其他畸形，由此给社会和家庭造成了严重的经济负担和精神痛苦 [3]。目前出生缺陷尚无有效治疗方法，只能通过胎儿染色体筛查与诊断预防此类患儿的出生。胎儿染色体病的传统产前诊断方式是通过获取胎儿的绒毛、羊水、脐血等来进行诊断，但是这些侵入性操作对胎儿和孕妇均有一定风险，可能导致宫内感染的发生，甚至有可能导致流产等不良后果[4]。近年来，随着二代高通量测序技术的发展，无创DNA产前检测技术（NIPT）的临床应用为我国出生缺陷儿的产前检测做出了极大贡献。本研究通过1183例高龄孕妇的无创基因检测结果分析与羊水染色体核型分析结果进行比较，探讨无创基因检测在诊断高龄孕妇胎儿染色体非整倍体疾病的早期诊断的优势和临床应用价值。现报道如下。

1.资料与方法

1.1一般资料

回顾性收集2018年1月至2022年10月在我院自愿进行无创DNA产前检测的单胎高龄孕妇1183例的临床资料。年龄35～45岁，平均（37.1±5.8）岁，孕周12～23-+6周，平均孕周（14.7±5.0）周，均为单胎妊娠。根据患者年龄将孕妇分为35-39岁组(n=1100)与年龄≥40岁组(n=83) 。纳入标准:（1）年龄≥35岁；（2）孕妇为单胎妊娠；（3）孕周12～23+6周；（4）孕妇1年内未接受异体输血；（5）孕妇及家属均要求先产前NIPT，拒绝直接羊水穿刺。本研究经医院伦理委员会批准。

1.2方法

1.2.1 NIPT本研究中所有试剂盒及DNA 高通量测序均由上海华大医学检验所有限公司完成。无创产前基因检测是通过采集5ml孕妇外周血，提取其中游离DNA采用二代高通量测序技术进行测序，通过测序技术将母体血浆中的cfDNA进行分析，将序列与对应的基因组匹配，以识别片段的染色体来源，通过将样本中某条特定染色体的染色体物质与一组参考染色体对比，对染色体是否有异常进行检测，得出胎儿患“染色体非整倍体”的风险率。对检测结果为阳性者进一步行羊水穿刺及胎儿染色体核型分析。对阴性者常规产检复查、 随访。

1.2.2孕妇羊水染色体核型分析 对NIPT结果提示染色体非整倍体高风险者或性染色体异常者，经知情同意后均接受羊水产前诊断，于孕 18 ～ 24 周转至产前诊断中心进行羊水染色体核型分析，进一步确诊并接受相关遗传咨询。对受检者均跟踪随访其妊娠结局。随访中未发现漏诊病例。

1.3观察指标

对妊娠结局随访主要采用电话随访、病案查询等方式，重点随访妊娠并发症、新生 儿情况等。

1.4统计学处理

采用SPSS21.0统计学软件对数据进行分析。计数资料采用例(百分率)表示，组间比较采用χ2检验。以p<0.05为差异有统计学意义。

2.结果

2.1两组患者治疗效果比较NIPT检测结果显示，染色体非整倍体高风险者共12例，其中，21-三体5例，18-三体2例，13-三体1例，性染色体异常4例。NIPT检测在高龄孕妇中阳性率为1.01%(12/1183)。其中，21-三体占异常结果的41.66%（5/12），18-三体占异常结果的16.67% (2/12)，13-三体占异常结果的8.33%（1/12)，性染色体异常占异常结果33.33%（4/12)，12例高风险孕妇其中自然流产1例，其余11例均做羊水穿刺，5例21-三体高风险均经羊水穿刺确诊，21-三体在高龄孕妇中的阳性预测值达到100%(5/5)，18-三体在高龄孕妇中的阳性预测值为50%(1/2)，1例13-三体经羊水穿刺排除，性染色体阳性预测值为50%(2/4)。35～39岁年龄组染色体异常高风险发生率为0.73%(8/1100)，年龄≥40岁组染色体异常高风险发生率为4.82%（4/83），两组比较，差异有统计学意义(P＜0.05﹚，见表 1。

2.2NIPT检测结果与羊水细胞染色体核型结果比较 对12例NIPT高风险者行羊水染色体核型分析，最终确诊21-三体5例， 18-三体1例，13-三体0例，性染色体异常2例。21-三体在高龄孕妇中的阳性预测值达到100%(5/5)，18-三体在高龄孕妇中的阳性预测值为50%(1/2)，1例13-三体经羊水穿刺排除，性染色体阳性预测值为50%(2/4)，见表 2。

表1    不同年龄组孕妇三体及性染色体阳性检出情况比较（

n）

表2    高龄孕妇NIPT和羊水细胞染色体结果对比（n）

3.讨论

随着孕妇年龄的增加，其卵巢微环境发生改变，女性卵巢功能衰退，而且外界环境中的各种有害物质的累积，遗传物质极易发生断裂、重排、不分离等畸变，因此，胎儿染色体异 常发生率随之增加。因此，高龄妊娠已经成为染色体非整倍体异常形成的独立高危因素。大部分的高龄孕妇孕育胎儿珍贵，而羊水穿刺属于有创检测技术并且存在误伤胎儿、致畸、流产及宫内感染的风险，且该技术存在检测周期长，技术要求高，工作强度大，细胞培养失败等缺陷[5]，孕妇对此存在顾虑而拒绝羊水穿刺，进而会发生漏诊，导致缺陷儿的出生。无创产前检测技术的优势可以极大的缓解孕妇本人和家属对于羊水穿刺所带来的心理负担。无创产前检测适用于高龄孕妇、血 清学筛查常染色体非整倍体临界风险或者高风险、以及不愿意接受羊水穿刺和有介入性产前诊断禁忌证的孕妇。产前筛查采用简便、可行、无创的检查方法，对发病率高、病情严重的遗传性疾病( 如唐氏综合征) 或先天畸形进行产前筛查，检出自带具有出生缺陷高风险的人群。NIPT 通过提取孕妇静脉外周血，利用高通量基因组测序技术和生物信息学分析技术判断胎儿是否患有染色体非整倍体疾病，其诊断准确率可高达 99. 9%［6］。而且NIPT 相对于传统的血清学筛查有着更高的准确性和更低的假阳性率［7-8］，已经广泛地应用于临床工作中，可作为超声检测和血清标志物检测的补充手段， 应用于诊断孕妇非整倍体疾病中［9］。本研究中，1183例高龄孕妇进行NIPT检测，仅12例高风险孕妇进行介入性产前诊断，羊水穿刺率为1.01% ，其可有效减少高龄孕妇侵入性产前诊断人数，降低侵入性诊断所带来的风险。本研究最终确诊21-三体5例， 18-三体1例，13-三体0例，性染色体异常2例。21-三体的阳性预测值达到100%(5/5)，18-三体阳性预测值为50%(1/2)，1例13-三体经羊水穿刺排除，性染色体阳性预测值为50%(2/4)。近期文献报道的假阳性率 0~0.3% 不相符[10]，可能与样本量较少，阳性例数少有关。性染色体非整倍体检测效率低与性染色体的特性有关，X 染色体含有较多的GC碱基对可导致测序的偏移，另外，1961 年，Mary Lyon提出了X染色体具有失活现象的假说，这种现象可能 会引起血浆中的游离 DNA 含量有所改变，进而在数据分析时会出现偏差。绝大多数的性染色体非整倍体的检测结果不一致与限制性胎盘嵌合、胎盘嵌合及胎儿嵌合[11] 有关。母体染色体嵌合是另一个可能原因，当核型异常的孕妇接受NIPT检测时，母体血浆中的X染色体浓度改变[12-14]，从而会出现结果不符。性染色体核型异常的多样性和临床表现的复杂性以及影响检测准确性的诸多因素使得NIPT在性染色体的检测中须努力。未来可通过SNP方法对性染色体非整倍体进行更为精准的无创检测，分析方法优化降低假阳性的比例。目前NIPT主要应用于胎儿染色体非整倍体的检测，随着测序深度的增加、检测样本量的增加、抓取信息的不断完善和全面信息分析方法的优化，准确性将会越来越高，筛查范围会不断扩展[15-16]。无创 DNA 产前检测技术对于21-三体、性染色体非整倍体（47，XXX、XXY、XYY）的异常检出率接近于产前诊断的水平，是血清学筛查和产前诊断的重要技术补充。此外，该技术有进一步发展的空间，可以有效降低侵入性产前诊断的数量，与此同时可以极大地缓解高龄孕妇本人和家属承担由于行羊水穿刺所带来的流产、感染、致使胎儿畸形的心理压力。无创DNA检测技术在灵敏度、准确性、安全性等方面所具有的优势使广大孕妇获益。[12]
   综上所述，NIPT 对高龄孕妇胎儿 21-三体、18-三体和性染色体有较高的检出率。但由于本研究样本数量的限制，对所检测指标尚需进一步探讨和研究。NIPT 检测结果尚存在假阳性或假阴性情况，目前还不能完全取代有创介入性产前诊断技术。

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