黄芪多糖对缺血性脑损伤大鼠的神经保护作用及其机制研究

黄芪多糖对缺血性脑损伤大鼠的神经保护作用及其机制研究

唐颖林  ,徐琼芳  ,简亚平

（永州职业技术学院，湖南 永州 425000）

摘要：目的：研究分析缺血性脑损伤后海马CA1区神经元重塑中粘附分子（NCAM）以及C-fos在黄芪多糖（AG）的影响后的表达。方法：本次研究所用大鼠来自Wistar雄性大鼠200只，将其分为10组每组大鼠20只，分组细节为：假手术组（SOG）、模型组(MG-1d；3d；7d)；低剂量黄芪多糖治疗组(L-AGTG-1d；3d；7d)；高剂量黄芪多糖治疗组(H-AGTG-1d；3d；7d)；MG及AGTG组行颈切口术致大鼠脑组织缺血后，经颈切除术封闭右脑中动脉；AGTG组以5mg/kg和15mg/kg的方式分别注射AG。于第1天、第3天、第7天进行脑血流量的重新灌流；对患者的神经损伤程度进行评定后，采集标本，计算凋亡神经元数量；免疫组织化学法和RT-PCR法半定量分析检测海马CA1区神经元NCAM和c-fos的表达。结果：与MG组相比，L-AGTG组及H-AGTG组的脑损伤分数及海马区凋亡神经元数目均明显降低（P<0.05、P<0.01)；与MG相比，海马CA1区域NCAM及c-fos蛋白的表达量均较高（P<0.05及P<0.01）。结论：经过研究分析黄芪多糖之所以可以改善缺血性脑损伤，有可能是促进海马MSAM和c-fos表达和组织或者逆转海马神经元凋亡相关。

关键词：黄芪多糖；海马；保护作用；机制

引言

神经凋亡神经元、神经递质代谢紊乱和自由基损伤是CNS发生发展的主要原因之一。神经凋亡神经元后的修复和再生非常困难，目前研究普遍将其归结为受损或受损的神经元沿着受损的方向进行轴突的重塑和功能连接的重构，而非单纯的对受损或受损的神经元进行替代。目前有很多的证据显示，神经细胞的生长特征是由一种特殊的遗传过程所决定的，这种过程受一种对细胞内的激素受体受体（Glycine）的影响。在中枢神经系统中，这个特征的基因可以被重新活化，从而引起神经纤维的增长和延长。本研究采用AG干预大鼠缺血性脑损伤模型，研究AG对大脑和海马神经元修复的影响。

1资料和方法

1.1材料

在某医学高等专科学校的实验动物研究基地购买了200只由行为学试验选出的符合标准的封闭型群体Wister雄老鼠。黄芪多糖（S07477-286，西格玛阿尔德里奇株式会社）；NCAM单克隆抗体（西格玛阿尔德里奇，Inc.，1:200)；全自动生化分析仪（TMS-1024i/Biolis，美国思博名)；立体显微镜（日本，SZX6745-J4型）；多普勒血流探测仪（ES-1000）血流量检测器（日本）；原位凋亡神经元检测试剂盒TUNEL（广州博理技术股份有限公司，TBD2020POD）原发凋亡测定工具；由上海生工（20100651批次）和c-fos（20100618批次）两种引物；-MK3(00120F006001，芬兰）；一种可调节的单轨迹加农炮（德国特雷利特牌）；由杭州朗基科技股份有限公司生产的MG96GPCR装置（YK0202023)；LG2020D系列的胶体成像分析系统，JY300+系列的胶体成像分析装置和JY-SCZ2系列的液池是北京君意东方网电子技术公司生产的；上海艾测电子技术股份有限公司生产的A1301026冷凝式离心分离器；美国DQ300Hoefer核苷酸-蛋白质的荧光定量分析装置（上海吉泰技术股份有限公司）。

1.2动物分组与给药

采用大鼠分组实验方法，将其分为假手术组(SOG)，模型组(MG-1d，3d，7d)、低剂量黄芪多糖治疗组(L-AGTG-1d，3d，7d)和高剂量黄芪多糖治疗组(H-AGTG-1d，3d，7d)，每组20只。L-AGTG、H-AGTG在2小时后，每天2次，5mg/kg、15mg/kg（用生理盐水2ml)，直到杀死，取材料。在SOG和MG缺血2小时后，每天2次注入相同体积的生理盐水（ip)。

1.3动物处理

大鼠采用10%水合氯甲醛麻醉（300mg/kg，ip)，平躺，右侧腹股沟切口，显露股静脉导管，以备后使用。颈内动脉纵向切口1-1.5cm，分层解剖，显露出颈总动脉，颈内动脉和颈外动脉。我们前期研究发现：1）大鼠在缺血后，可在缺血状态下观察到明显的缺血再灌流；2）大鼠可观察到不同程度的缺血后对缺血后的影响；3）可观察到缺血后大鼠的缺血状态。然后将相同的丝绳顺着颈外血管的残尾，从颈部和颈部的主干血管的交界点，慢慢的将其拉到颈部的头颅交界点，并将其拉到颈部的头颅交界点，将其拉近到（1.7+0.2)cm左右，切断了对脑中动脉的血液流动。MG、L-AGTG及H-AGTG三种治疗方法均于2小时后轻拔栓线，并于术后1、3、7天内取回供血。SOG仅在静脉显露时进行封闭。手术结束后，需要保证室内温度不超过25摄氏度，同时需要将肛温维持在37±0.5摄氏度。剔除手术后的大鼠，NIPs得分最终获得符合标准的SOG 20只，MG和L-AGTG-1d，3d，7d各20，16，18只；H-AGTG-1d组、3d组和7d组分别为16、18和16只。

1.4神经功能缺损评分（NIPs）的评定

制作模型之前及取标本之前，采用贝德逊等神经缺陷（NIPs）进行评定。也就是0，没有任何精神障碍；1点：在缺血性卒中时，对侧肢体发生弯曲；2：在无意识运动中，不做对一侧旋转动作，在一侧脑梗死部位用力推动时，肌肉阻力减小；3：当患者在运动中，当患者在对侧脑室进行旋转，并在对侧脑室进行按压时，肌肉阻力减小。

1.5病理学检查与凋亡神经元计数

在每一个不同的时辰（第1天，3天，7天），切断头部，取出脑部，快速将整个脑部放入生理食盐中，然后将整个脑部分离，取出其中的半部，用4%多聚福尔德法浸泡，然后进行脱水，透明，浸蜡，包埋，切片，脱蜡，Bielschow-sky染色，在光学显微镜下观测端脑和海马区的病变。另外，将海马CA1区域的冠状脑及海马的CA1区域分别取3块（2mm厚度），置于2%TTC溶液中，于37℃恒温条件下，避免光照照射，30分钟后取活检。每张片每个部位取10个视野，在光学显微镜下观察神经元凋亡情况，用图像分析仪统计凋亡神经元率(凋亡率=凋亡数/总数×100%)。

1.6免疫组织化学研究

根据资料，先用4%多聚福膜将大鼠脑组织固定12小时，再用25%的蔗糖水浸于大鼠底部，取出大鼠脑组织。采用冠状动脉冷冻方法，取海马CA1区域及脑组织，取20微米厚度的薄层。将脑前部1.2~1.6mm之间的切片用0.3%H2O2乙醇（将其去除）进行清洗，然后将其浸泡在Tr-itonX-100的PBS中（含量0.01mol/L)，并用正常马血清的血浆将其进行封闭0.5小时，以阻止非特异性IgG的结合。采用ABC方法，将NCAM的比例为1:200的单抗装于湿润的盒子中，冷藏36小时（4度恒温），然后用PBS洗涤5分钟，共3次，并用马抗大鼠IgG（1:200biotin）及过氧化酶复合物（1:100biotical-白素-生物素）孵化。DAB在发色剂DAB上呈色剂10分钟后，用清水洗涤，苏木碱重染液，用梯度乙醇进行脱水剂。二甲苯（xylene）是半透明的，用GUM密封，显微镜下观测。

1.7海马组织总RNA提取与鉴定

按照相关的文章，采用RT-PCR法半定量地对c-fos374ChinJAPlPhysiol2012，28(4)（用Trizol方法萃取）的mRNA含量进行了测定。首先取60-80毫克的大鼠的海马体，然后加1毫升的Trizol，然后用匀浆装置匀浆成液体状。将该均匀浆料放在1.5ml的离心器中，25度放置3分钟后，用4000r/min(4度，12000xg）的离心器进行10分钟的离心，取出上清液移至另一根离心器中，以除去不溶解的组织沉渣。将200微升的三氯甲烷加到上层清液中，反转混合15秒，在25度下放置3分钟，重复以上步骤，再进行15分钟的离心。将上层清分取出，放入另外一支离心试筒，再放入500微升的异丙醇，并摇动。将RNA在25度下放置10分钟，如法炮制，再进行10分钟的离心，除去上层，再用1毫升75%的酒精将RNA沉降物清洗干净，搅拌均匀后，在4度下用7500xg的离心力进行5分钟的离心，除去上层，在25度下进行烘干，使RNA在25度下进行5-10分钟的沉降，然后用50微升的二乙基焦磷酸胺（DEPC）进行消毒，然后在55度的水浴法中进行加热，10分钟的时间内将RNA进行稀释。用5微升的琼脂进行甲醛变凝胶电泳进行鉴别，然后将5微升的样品放入45微升的DEPC消毒过的无菌水中，以RNA的数量为指标，以RNA的数量为指标，将剩余的RNA液体放入-85度的冰箱中。

1.8图像与数据处理

应用CMIAS-008型机对NCAM阳性细胞吸光度进行了测定。采用SPSS10.0软件对各项指标进行了统计学处理。

2结果

2.1AG对大鼠脑梗死后海马中NCAM及NIPs的影响

NIPs含量随着治疗时间的增加而降低。L-AGTG、H-AGTG的NIPs显著低于MG，而H-AGTG的NIPs则低于L-AGTG(P<0.05、P<0.01）。海马中NCAM蛋白在不同的时相上表现为SOG

2.2海马CA1区域组织学及凋亡神经元的变化

海马内的锥体节神经元，形态规整，胞膜完好，顶部的树突大，多数为球状或卵状，细胞核多为球状或卵状，核内层的着色一致，核内层的颜色较为一致；结果：MG的纤维密度较高，排列杂乱，有的相互结合，呈宽频带，银染加重，有丰富的NFT，锥体细胞核轻微膨胀，核固缩，细胞核内的染色质致密，核膜模糊；L-AGTG-7d区的细胞纤维分布不均匀，局部致密，有少量的NFT；H-AGTG-7d的细胞纤维束分布整齐，致密，无NFT形成。SOG中的神经细胞没有发生凋亡，而其它的组会随着时间的流逝，神经凋亡神经元率会有很大的增加（P<0.05)，并且在同一时期，凋亡神经元有很大的差别，SOG

2.3大鼠海马CA1区域beta-actin和c-fosm RNA的表达谱

从左侧到右侧，分别为SOG，MG-7d，L-AGTG-7d，H-AGTG-7d和DNA标记。海马RNA-DNA-凝胶电泳显示28S，18S，5S3条谱线，其中，头二条荧光信号强度最大，最后一条荧光信号强度最小。在0.926的比率下，RNA的光学吸收率是A250，而RNA的光学吸收率是270，这表明其具有可信的RNA的纯度。c-fosmRNA的电泳分析显示，与SOG、MG相比，L-AGTG-7d的表达水平明显增强，并且H-AGTG-7d的表达水平更高。以上结果表明，AG可明显上调c-fos的mRNA水平。

2.4RT-PCR法半定量分析大鼠脑组织中c-fos的表达

研究发现，在MG大鼠的海马中，c-fos和beta-actin的灰度值随着时间的延长而升高；L-AGTG大鼠海马c-fos和beta-actin的灰度值升高较MG大鼠明显，而H-AGTG大鼠的灰度值升高较H-AGTG大鼠明显（P<0.05和P<0.01）。

3讨论

在脑缺血性损害消失后，受损的神经细胞会逐步进行修复，而在这个修复和再生的进程中，一定会有与之有关的一些分子的表达。文献表明，c-fosmR-NA在特定区间的高水平可提高大鼠的学习和记忆能力。c-fos在大脑中主要是调控细胞信号的整合、传导、分析和凋亡神经元等过程，并与学习、记忆和认知能力密切关联。c-fos在细胞内的表达较少，因此，c-fos在细胞内的作用机制，包括神经元的分化和生长，学习记忆，以及神经突触的可塑性改变。这可能是由于c-fos通过调控其表达，进而调控了其对下游目标基因的表达，进而改变了新的蛋白的形成，进而改变了其对学习和记忆的编码方式，进而促进了其在学习和记忆中的表达。有文献表明，在海马CA1区域中，c-fos的原癌蛋白Fos在单细胞中呈高水平高水平，可促进受损的神经细胞的再生和重构，并加快其修复。研究发现，通过上调c-fos在大脑中的表达，可以提高大脑的学习和记忆力。我们前期实验结果表明：AG处理大鼠，其脑内CA1区域的神经纤维化显著改善，且随着给药剂量的增大，其密度降低，NFT最终消退，且其细胞数目显著增多（P<0.05、P<0.01）。说明AG对大鼠海马区细胞的损伤具有一定程度的量效关系。据此推测，AG降低了受损的神经功能分数，提高了大脑的正常工作能力，并在一定程度上逆转了海马区细胞的病变，这可能与其促进了c-fos的表达有关。

综上所述，黄芪多糖改善缺血性脑损伤大鼠的神经功能；可能与促进海马NCAM和c-fos表达；而阻止或逆转海马神经元凋亡有关。

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基金项目：本文系2021年度湖南省教育厅科学研究项目《黄芪多糖减轻早产鼠脑损伤的作用机制研究》（项目编号：

21C1521）研究成果。

作者简介：唐颖林（1981—），女，湖南东安人，硕士，讲师。研究方向：医学教育、儿科疾病诊治。