香榧肽的制备工艺研究

香榧肽的制备工艺研究

董建国,李磊,贺雪峰,赵龙龙,吕慧,苏欣,乔慧,李晓芳,闫雅非,郝麒麟

内蒙古三主粮天然燕麦产业股份有限公司内蒙古自治区呼和浩特市010000

摘要：以香榧饼粕为原料，α-葡萄糖苷酶抑制率为主要考察指标，通过单因素

试验优化香榧肽的制备工艺。结果表明，香榧肽的最优酶解工艺参数为:碱性蛋白酶添加量10000U/g，酶解pH值10.0，酶解温度55°C，酶解时间3 h，此时酶解制得的香榧肽，口感微甜，流动性好。本研究结果为开发功能食品提供了理论基础。

关键词：香榧，肽，α-葡萄糖苷酶抑制率

香榧，别名中国榧，俗称妃子树。为红豆杉目、红豆杉科、榧树属常绿乔木，中国原产树种，是世界上稀有的经济树种；传统中医药学认为，榧子具有消除疳积、润肺滑肠、化痰止咳之功能，适用于多种便秘、疝气、痔疮、消化不良、食积、咳痰症状。榧子可以用于多种肠道寄生虫病，如小儿蛔虫、蛲虫、钩虫等，其杀虫能力与中药使君子相当[1-3]。香榧种仁含有丰富的营养物质，其中含油率50%以上[4]，榨油逐渐成为香榧深加工的重要途径之一。香榧饼粕中蛋白含量约为23.38%[5]，但其仅被用作动物饲料或废料处理，造成了资源的极大浪费。因此，必须提高香榧饼粕的综合利用率，推动香榧产业的发展。

本研究筛选适宜制备香榧肽的蛋白酶，采用单因素实验优化水解工艺条件，以期制备一种活性肽，为开发香榧功能食品提供参考。

1材料与方法

1. 1材料与试剂

香榧由内蒙古三主粮天然燕麦产业股份有限公司提供，木瓜蛋白酶、风味蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶、复合蛋白酶，沧州夏盛酶生物技术有限公司。

1.2 主要仪器与设备

XHF-DY型高速分散器，TDL- 5离心机，HH-6型水浴锅。

1.3 试验方法

1.3.1 香榧蛋白的制备

香榧仁冷榨得到香榧饼粕，粉碎，用石油醚(1:5) 进行脱脂。将残渣在45°C干燥后过60目筛，得到脱脂粉。

将脱脂粉与水以1:20的比例混合后，用1.0 mol/L的氢氧化钠溶液调至pH10.0，在50°C水浴锅中搅拌2h，离心(4 000 r/min，20 min)。用1.0 mol/L盐酸将上清液调至pH4.0，室温沉淀蛋白质2h，离心(4 000 r/min，20 min)。将分离的沉淀物复溶，调至pH7.0后干燥。得到香榧蛋白，在-20°C 储存备用。

1.3.2 蛋白酶的筛选

固定底物浓度为3%，蛋白酶添加量为8000U/g，5种蛋白酶分别在不同pH及温度条件下，酶解5h后沸水浴灭酶10 min，离心(8000 r/min，30min) ，取上清液测定α-葡萄糖苷酶抑制率，筛选最佳的蛋白酶。

取500 μL样品，加入500 μL的a-葡萄糖苷酶溶液(6 mol/L)，于37°C水浴中孵育10min 后，加入500 μL pNPG (2.5 mmol/L)溶液，进一步孵育40 min后，立即加入2.0 mL Na2CO3 (0.2 mol/L)终止反应，在405 nm下测定吸光值，抑制率按式计算:

式中:Y为α-葡萄糖苷酶抑制率/%;A0为对照组吸光值;A1为样品组吸光值;A2为背景组吸光值。

1.3.3单因素实验设计

固定底物浓度为3%，分别以蛋白酶添加量(4000~12 000 U/g)，酶解pH值(8~12)，酶解温度(40~60℃)，酶解时间(1~5h)为单因素，以α-葡萄糖苷酶抑制率为指标，确定最佳水解条件。

2结果与分析

2.1蛋白酶筛选

由于不同蛋白酶酶解香榧蛋白的作用位点不同，会造成蛋白酶解物的结构、数量和活性有所差异。由图1可知，5种酶对香榧蛋白水解后，都具有α-葡萄糖苷酶抑制活性，且随着酶解时间的增加而增强，表明香榧蛋白适宜作为制备肽的原料。其中，碱性蛋白酶水解液抑制活性最强，显著高于其他蛋白酶(P<0.05) 。

图1不同蛋白酶对a-葡萄糖苷酶抑制率的影响

2.2蛋白酶添加量

由图2可知，α-葡萄糖苷酶抑制率随碱性蛋白酶添加量的增加而增加。当酶用量为10000U/g时，α-葡萄糖苷酶抑制率达到最大值，因此，蛋白酶添加量确定为10000U/g。

图2蛋白酶添加量对香榧蛋白酶解的影响

2.3酶解pH值

由图3可知，随着酶解pH值的升高，α-葡萄糖苷酶抑制率呈先增加后降低趋势，这可能是因为蛋白酶分子活性中心的构象受pH值影响较大，导致其与底物结合速率发生改变，从而造成蛋白水解度降低，在pH值为10.0时，α-葡萄糖苷酶抑制率都达到最大值，因此，酶解pH值确定为10.0。

图3酶解pH值对香榧蛋白酶解的影响

2.4酶解温度

由图4可知，随着酶解温度的升高，α-葡萄糖苷酶抑制率先增加后降低。这可能是因为温度升高，使一些对温度敏感的肽的活性被抑制，从而造成α-葡萄糖苷酶抑制率降低，且温度过高会导致酶失活，从而造成蛋白水解度降低。在酶解温度为55℃时，α-葡萄糖苷酶抑制率和蛋白水解度都达到最大值，因此，酶解温度确定为55℃。

图4酶解温度对香榧蛋白酶解的影响

2.5酶解时间

如图5所示，随着酶解时间的延长，α-葡萄糖苷酶抑制率呈现先上升后下降的趋势，当酶解时间达到3h时，酶解物对a-葡萄糖苷酶抑制活性达到最大值确定酶解时间为3 h。

图5酶解时间对香榧蛋白酶解的影响

3结论

以香榧饼粕为原料，α-葡萄糖苷酶抑制率为主要考察指标，通过单因素试验优化香榧肽的制备工艺。结果表明，香榧肽的最优酶解工艺参数为:碱性蛋白酶添加量10000U/g，酶解pH值10.0，酶解温度55°C，酶解时间3 h，此时酶解制得的香榧肽，口感微甜，流动性好，有利于对其进行进一步的产品开发。

参考文献：

[1]WUJ S, HUANG J D, HONG Y W, et al. De novo transcriptome sequencing of Torreya

grandis reveals gene regulation in sciadonic acid biosynthesis pathway[J]. Industrial Crops

and Products, 2018, 120(4): 47-60

[2] MENG XH, XIAOD, YE Q, et al. Positional distribution of△5-olefinic acids in tri acylglycerols from Torreya grandis seed oil: isolation and purification of sciadonic acid[J].

Industri al Crops and Products, 2020, 143: 1-8

[3] SHI LK, MAO JH, ZHENG L, et al. Chemical characterization and free radical scavenging

capacity of oils obtained from Torreya grandis Fort. ex. Lindl. and Torreya grandis Fort. var.

Merrilli: a comparative study using chemometrics[J]. Industrial Crops and Products, 2018,

115(2): 250-260

[4]温思思，陆元超,J珏,等.金松酸对HepG2细胞中甘油三酯蓄积的影响[J].中国粮油学

报, 2022: 1-12.

[5] 于美.香榧子蛋白及饼粕水提取物的研究[D]无锡:江南大学，2017: 10