MALDI-TOF MS质谱技术在疑难血型标本鉴定中的应用

MALDI-TOF MS质谱技术在疑难血型标本鉴定中的应用

刘晓娥

绵阳富临医院  621000

摘要：目的:探讨是否可能利用MALDI-TOF MS质谱技术，帮助识别肿瘤患者中的ABO困难血型，以有效预防疾病引起的干扰。该方法采用血清蛋白法和PCR-SSP链反应法，这是一种基因测序技术，用于鉴别20例与ABO血型正反定型观念不符的肿瘤患者(其中10例为血液系统恶性肿瘤患者)；还对这些患者的输血影响进行了回顾性分析。结果，这一组肿瘤患者中25%(5/20)的困难血型样本显示抗原a和/或b减弱，分别有两个MDS病例、一个前列腺癌病例和两个AL病例；45%(9/20)A或b抗体减弱，最初有4例MM、1例WM、1例AGL、1例肝癌、1例右结肠癌和1例食道癌；ABO子类型为30%(6/20):1 bel 09/02.1b(a)04/o2.1b(a)02/b.2 bel 03/o；一个例子是新的a型亚等基因:测序结果是797个位置发生突变，根据其他位置的突变判断，其特征为A102/O01。基因型与血清类型的一致性率为75%(15/20)。60%的病人(20人中有12人)接受了输血治疗，没有进行可溶性输血，75 %的病人(12人中有9人)获得了所需的效率。结论首次将MALDI-TOF MS质谱技术应用于国内困难临床标本血型遗传分组。与PCR-SSP相比，MALDI-TOF MS系统具有速度、高吞吐量和高特异性等优点，有助于识别困难血型和检测稀有血型。

关键词：MALDI-TOF MS质谱技术；疑难血型；鉴定

引言

近年来，血型基因分组技术已成为识别困难血型的重要辅助技术。MALDI-TOF质谱法直接测量一种物质的分子质量，具有高度的特异性和准确性，可通过一个孔分析多达40种反应，并具有低速度、低成本和低流量的优点，近年来在以下领域得到广泛应用一些国际研究人员利用质谱技术对红细胞的类型进行了研究。但是，由于不同血型抗原在地理或人口方面的差异，报告的检测系统涉及的中国人口特定部位较少，或者不包括特定血型系统，也不适用于难以进行国内临床鉴定的血型。本实验室以核酸质谱技术为基础，建立了一个适合中国人群稀有血型检测和困难样本鉴定的检测系统，对21组红细胞中的61个部位进行了基因分类。本研究采用建立的质谱测试系统，首次在我国应用MALDI-TOF MS质谱技术对困难血型进行临床鉴定。

1资料与方法

1.1一般资料

从2021年11月至2022年11月，收集了20个不符合ABO血型正反定型观念的肿瘤样本，其中10个来自医院血液科的恶性血液系统肿瘤样本，在需要输血时进行了检查；另有10例来自中国医学科学院肿瘤医院泌尿外科、胸外科、妇科和普通外科的临床服务，在为手术准备血液时进行了检查；所有输血前的兼容性测试都发现ABO陈规定型观念存在积极和消极的不一致(表1)。14名25至86岁的男性和6名女性(61.5 15.8岁)。鉴定样本为5mL/(人)(EDTA-K3抗凝血)患者的外周血液样本，全部ABO血液检测均在取样后的当天进行，< 1周血液样本提取DNA。

1.2方法

微柱凝胶卡离心机(生物轮、id-离心机12 SII)和孵化器(生物轮、id-孵化器37 SI)、KA-2200红血球洗涤离心机(久保塔公司)、SSW-600-2S太阳能热水槽(上海博世)、veritipo 96 well放大器PCR(应用生物系统)、flux cytoflex lx流式细胞仪。

1.3观察指标

血型血清学鉴定；ABO血型PCＲ-SSP基因分型鉴定；ABO基因第1—7外显子测序；ABO疑难血型肿瘤患者输血效果的回顾性分析。

1.4统计学方法

采用SPSS.0对研究对象采集的数据进行分析处理，计量数据采用(±s)表示；计数资料采用%表示，使用χ2对数据进行校检；P>0.05为差异无统计学意义。

2结果

2.1血型血清学鉴定见表1。

表120名各类肿瘤患者ABO疑难血型血清学、PCＲ-SSP和测序结果

2.2ABO血型PCＲ-SSP基因分型鉴定

根据与所确定的每一个样品对应的试剂反应剖面的基因型样本，血型与ABO肿瘤患者血型的匹配率为75%(15/20)，5个样品(4、5、6、7和11)在血清类型方面存在差异。

图1PCＲ-SSP基因分型结果的凝胶电泳(示例)

2.3ABO基因第1—7外显子测序

在20个肿瘤患者的ABO困难血液样本(样本3、4、5、6、7、11)中，有6个接受了ABO基因次级指标1至7的序列分析，而抗原基因突变数据库显示存在B1/O1异构体，Bel09/O(表1)；其中，n 7样品在位置797发生了突变，NCBI中不包括该点突变的基因型，因此，根据其他点的突变情况，它被认为是一种自然突变，具有A102/O01的特征，是一种新的单一基因(图2)。

图21例(7号标本)A102/O01新等位基因突变位点

2.4ABO疑难血型肿瘤患者输血效果的回顾性分析

这一组的12名病人接受了输血治疗，其中1名(1名)接受了紧急输血(带有o型洗红细胞和AB型血小板，但需符合血液剂量检测标准)，10名(2名、3名和12名-19名)接受了相同的ABO血型，1名(8名)接受了紧急输血所有转诊病人都没有进行可溶解的输血，75 %的病人(12人中有9人)达到了输血的预期效果，只有3人部分有效(表2)。

表212名ABO疑难血型肿瘤患者输血疗效分析

3讨论

高频抗原(HFA)是一类血型抗原，一般发生在99%以上的人群中。由于存在高频抗体，在意外抗体检测和鉴定中，HFA个体对泰米尔耐药细胞和光谱细胞的抗凝血能力没有完全阳性反应，无法判断抗体的特异性。另一方面，稀有血型抗体试剂的销售种类不多，价格昂贵，因此很难用血清方法识别稀有血型。malti-tofms核酸质谱技术具有柔性靶设计、高通量、速度等特点。并且可以检测多种类型的突变，例如SNP、In/Del。1995年TangK对DNA序列进行第一次具体分析后，这种检测技术被广泛应用于微生物学、法医学、肿瘤学、药理学遗传学和血液学等领域。为了满足临床罕见血型患者的血液需求，国际输血协会于1965年设立了稀有血型问题专题调查委员会，以促进稀有血型之间的国际互助。由于运输和储存血液等问题，国际援助无法保证在紧急情况下提供紧急血液，因此自1985年以来在中国全国范围内逐步进行了稀有血型的检测。目前，国内销售的光谱细胞缺少di ( B-)、p和Jr ( a-)等稀有红细胞和销售的稀有抗体检测试剂。因此，Diego、P1PK和Jr等血液系统中罕见现象的检测主要依靠血清鉴定。

结束语

本研究利用核酸质谱技术开展疑难血型标本基因分型并正确鉴定，为国内首次报道。相较于PCＲ-SSP等分型手段，MALDI-TOF MS具备快速、高通量、高特异性等优势，其应用可以辅助临床开展疑难标本血型鉴定，同时也为高效开展稀有血型筛选及稀有血型库建立工作提供了技术基础。

参考文献

[1]马晓莉,刘丹,金新莉,耿明璐,王丽萍,刘佳璇.42例疑难ABO血型的血清学与基因分型[J].中国输血杂志,2020,33(12):1245-1247.

[2]侯萍,李晓丰,李剑平.沈阳地区献血者疑难血型鉴定原因分析及处理措施[J].检验医学与临床,2020,17(02):223-224.

[3]张印则,徐华,周华友.疑难ABO血型血清学鉴定策略及输血探讨[J].中国输血杂志,2019,32(07):619-621.

[4]肖英,李云宝.疑难血型248例鉴定原因分析及鉴定方法探讨[J].世界最新医学信息文摘,2019,19(48):355+358.

[5]胡俊华,李喜莹,张芃,刘燕明,赵学彬,田胜辰,宫济武.基因分型技术在肿瘤患者ABO疑难血型鉴定中的应用[J].中国输血杂志,2019,32(04):342-346.