日本血吸虫感染小鼠血清IL-2、IL-4和IL-10动态变化

日本血吸虫感染小鼠血清IL-2、IL-4和IL-10动态变化

曾凡胜，谌蓉，李瑜，杨杰，何露

益阳医学高等专科学校/益阳市环洞庭湖区血吸虫与病原生物控制技术重点实验室，湖南益阳 413000

[摘要]  目的  检测日本血吸虫感染小鼠血清IL-2、IL-4及IL-10的动态变化，探讨IL-2、IL-4及IL-10在日本血吸虫感染中的应答特征。 方法  建立日本血吸虫感染的小鼠模型，采用ELISA法检测小鼠感染后2、4、6、8、10、12周血清中IL-2、IL-4及IL-10水平。同时设立正常小鼠对照组。结果  日本血吸虫感染小鼠血清IL-2在第2周迅速增加，第4周达到高峰，之后从第6周开始下降，但至12周仍维持高水平，显著高于对照组小鼠（P<0.05）；IL-4和IL-10水平在感染第6周才开始快速升高，至第10周血清中IL-4和IL-10水平达到高峰，之后开始缓慢下降，但至12周仍维持高水平，显著高于对照组小鼠（p<0.05）；第6周也是血吸虫开始产卵之时，肝脏肉芽肿启动并逐渐增大，至第10周，血清IL-4和IL-10水平与肉芽肿体积呈现明显正相关（P<0.05）。结论  血吸虫产卵前，lL-2水平在第2周就开始显著升高，提示lL-2参与血吸虫感染早期的免疫病理过程；从第6周血吸虫产卵后，IL-4和IL-10水平逐渐升高，并伴有肝脏肉芽肿炎症反应的启动和增强，提示IL-4和IL-10可能在肉芽肿的形成、发展和后期纤维化过程中发挥着免疫调节作用。

[关键词]  日本血吸虫；小鼠；白细胞介素2；白细胞介素4；白细胞介素10

[中图分类号]               [文献标识码]  A

Dynamic expressions of IL-2、IL-4 and IL-10in mice inected with Schistosoma japonicum

ZENG Fan-sheng, CHEN Rong, LI Yu,YANG Jie, HE Lu

(Yiyang Medical college/Key Laboratory of control technique for Schistosoma and pathogen infection for Dongting lake region Yiyang Medical College, Yiyang 413000)

[Abstract]  Objective To detect the levels of IL-2, IL-4 and IL-10 in mice with Schistosoma japonicum infection, to explore the response characteristics of IL-2, IL-4 and IL-10 in mice infected with Schistosoma japonicum. Methods Murine models of Schistosomiasis japonicum was established.Sera were assayed for IL-2, IL-4 and IL-10 levels every two weeks postinfection and comparison by ELISA.  Results IL-2 in sera from infected mice were increased rapidly at week 2,peaked at week 4 and declined sharply after week 6.On the contrary, IL-4 and IL-10 were increased apparent  at week 6,peak was observed at week 10,then slowly decline,but remained significantly higher than controls at week 12, p<0.01.Conclusion There is a significant increase in the early stage with Schistosoma japonicum infection, IL-2 may play important roles during the immune process in the early stage.However, as the infection progress and produced eggs at around week 6, there was a gradually increase for  IL-4 and IL-10. As suggested,  IL-4 and IL-10 might promote the development of hepatic granulomas.

[Key words] Schistosoma japonicum; Mouse; IL-2; IL-4; IL-10

日本血吸虫与人类已经共存了几千年，在此过程中，人类的免疫系统在持续进化，日本血吸虫也在不断适应宿主的免疫机制。近年来，国内外大量研究结果显示辅助性T细胞（Th）是日本血吸虫感染的重要效应细胞[1-3] 一般认为Th至少可以分为I型和Ⅱ型两类。目前认为，日本血吸虫早期感染，以I型辅助性T细胞（Helper T cell,Th1）分泌白细胞介素2（Interleukin,IL-2）和IFN-γ等细胞因子为主要特征；而日本血吸虫产卵后，则以Ⅱ型辅助性T细胞（Helper T cell,Th2）分泌的细胞因子为主，如IL-4和IL-10等[4-6]。以往对细胞因子水平的研究，多集中在反映局部免疫应答能力的肝脏、脾脏等的研究，而对反映全身性Th免疫反应状态的血清细胞因子研究较少。血清标本具有方便和容易得到、非侵入性采样等优势，是疾病诊断标志物的理想来源[7-9]。本研究旨在通过建立日本血吸虫感染小鼠模型，检测产卵前后血清IL-2、 IL-4和 IL-10的动态变化，为进一步明确日本血吸虫感染免疫机制、筛选血吸虫病诊断的血清学标志物提供参考和依据。

1  材料与方法

1.1  实验动物分组与处理  6周龄无特定病原体（specific pathogen free, SPF）级C57BL/6雌性小鼠购自中南大学实验动物中心（许可证号SCXK（湘）2019-004），SPF条件饲养，实验经学校实验动物伦理委员会批准（批准号YYMC2021003），感染日本血吸虫的阳性钉螺由湖南省寄生虫病防治研究所提供。将小鼠编号后随机分为2组，感染组共40只小鼠，对照组共25只小鼠。

1.2  主要试剂与仪器  IL-2、IL-4和IL-10的ELISA试剂盒均购自eBioscience公司（LOT4313392），酶标仪（Multiskan  FC）、洗板机（Thermo fisher washer 888）均购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司，低温高速离心机（Fresco 17）、移液器（0.5-10ul，10-100ul）和EP管均购自eppendorf 公司，标本检测严格按试剂盒说明书进行。

1.3   小鼠感染与血清收集  感染组每只小鼠经腹部皮肤感染（25±1）条日本血吸虫尾蚴，每日监测小鼠死亡情况，感染后分别于2、4、6、8、10、12周检测一批小鼠，每批小鼠包括感染小鼠5只和对照组小鼠3只，收集小鼠血清-20℃冰箱保存待查。

1.4  肝脏肉芽肿检测  取小鼠肝脏经福尔马林溶液固定，石蜡包埋，HE染色后于显微镜下观察感染小鼠肝脏的病理变化，每只小鼠检测20个单卵肉芽肿，采用显微镜测微尺测量肉芽肿纵向最大直径（R），以及横向最大直径（r），根据公式V=兀Rr2/6估计肉芽肿体积，取平均值代表该小鼠肉芽肿大小[10-12]。

1.5  统计学分析  采用SPSS15.0统计软件对数据进行统计学分析，正态分布数据以（x±s）表示，采用t检验分析。对血清IL-4和IL-10与肝脏虫卵肉芽肿体积之间的相关性进行分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2  结果

2.1  小鼠血清中IL-2的变化  日本血吸虫感染小鼠血清中IL-2浓度从第2周开始明显升高，于感染后第4周前后达到高峰，从第6周开始快速下降，但直到实验结束的第12周，感染组小鼠血清中的IL-2水平始终高于对照组小鼠（P<0.05）（见图1）。

图1  小鼠血清中IL-2水平变化（*表示与正常对照组比较P<0.05）

2.2 小鼠血清中IL-4和IL-10的变化  日本血吸虫感染组小鼠血清中IL-4和IL-10水平变化规律基本相似。感染前4周，血清中IL-4和IL-10水平无明显变化。从感染后第4周开始，IL-4、IL-10水平开始上升，至第6周也是血吸虫开始产卵的时点，此时IL-4和IL-10水平明显高于对照组（p<0.05）。此后继续上升，至第9周达到高峰。感染第9周后略有降低，但依然维持在较高水平，直至实验结束的12周末，血清中的IL-4和IL-10水平依然显著高于对照组（见图2和图3）。

图2  小鼠血清中IL-4水平变化（*表示与正常对照组比较P<0.05）

图3  小鼠血清中IL-10水平变化（*表示与正常对照组比较P<0.05）

2.3  血清中IL-4和IL-10水平与肝脏肉芽肿体积的相关性  收集日本血吸虫感染小鼠血清检测后发现，感染第6周是IL-4和IL-10水平变化的转折点。通过观察日本血吸虫感染小鼠肝脏肉芽肿形成及体积变化的趋势，可以发现血吸虫产卵的时点第6周，所有感染小鼠肝脏中均检出日本血吸虫虫卵，随着时间延长肉芽肿体积也逐渐增大，但至第12周，感染小鼠部分肉芽肿纤维化而体积缩小。第6周感染小鼠肝脏肉芽肿体积（x±s）为0.95±0.05×10

-3mm3，第8周（x±s）为3.2±0.05×10-3mm3，第10周（x±s）为9.0±0.06×10-3mm3，第12周（x±s）为2.96±0.15×10-3mm3。至感染第10周，血清IL-4、IL-10水平与肉芽肿体积变化显著正相关（r=0.96，P<0.05）。

3  讨论

细胞因子是由免疫细胞及组织细胞分泌的一类小分子可溶性多肽蛋白，具有多种生物学功能，如调节免疫应答、参与炎症反应、调节细胞生长与分化成熟和抗肿瘤等[13-14]。辅助性T细胞（Th）是日本血吸虫感染的重要效应细胞，至少可以分为Th1和Th2两类，主要通过分泌细胞因子发挥免疫效应，Th1主要分泌IL-2和IFN-γ等细胞因子，Th2则以分泌IL-3、IL-4和IL-10等细胞因子为主要特征。其中IL-2被称为T细胞生长因子，可促进T细胞活化、增殖分化为成熟的效应细胞，还可刺激其他细胞因子的分泌；IL-4则是典型的Th2型细胞因子，可促进B细胞活化、增殖分化为效应细胞，同时IL-4还可抑制Th1细胞活性；而IL-10则是一种具有广泛抑制活性的细胞因子，可抑制T细胞、单核巨噬细胞等的活性，在日本血吸虫感染过程中发挥重要的免疫调节作用[15-17]。

  以往研究多集中在脾细胞培养液中的细胞因子水平，反映的仅仅是脾细胞Th免疫应答能力。本研究通过系统检测日本血吸虫感染小鼠血清中细胞因子（IL-2、IL-4和IL-10）的水平，反映的是全身性Th免疫反应情况，弥补了以往研究的不足，可以为全面了解Th的免疫反应变化，研究血吸虫病提供参考和依据。我们的研究结果还显示，血吸虫产卵之前，宿主辅助性T细胞（Th）表现为Th1反应极化，以急性期症状为主要特征；而产卵之后（感染第6周之后），病程逐渐进入慢性期，小鼠肝脏肉芽肿开始形成，体积逐渐增大，这与Th2反应启动和变化的趋势一致。结合肝脏肉芽肿检测结果发现，至感染第10周，Th2反应与肝脏肉芽肿体积存在显著正相关，提示Th2反应在肝脏肉芽肿的发展过程中发挥着重要作用，提示产卵后主要表现为Th2反应极化。此外，相对于肝脏、脾脏等组织标本，血清标本具有方便和容易得到、非侵入性采样等优势，结合血清IL-2、IL-4和IL-10动态变化规律，细胞因子可望成为急性、慢性血吸虫病鉴别诊断的重要标志物。

  作为血吸虫感染的重要效应细胞，Th细胞是通过分泌细胞因子发挥作用。在日本血吸虫感染早期，IL-2等Th1型细胞因子水平快速上升并达到高峰，随着感染进展，感染后第6周，血吸虫开始产卵，Th1型细胞因子水平逐渐降低；而血吸虫产卵后，病程进入慢性期，Th2型细胞因子（IL-4和IL-10等）水平迅速增加并逐渐占据主导地位[18-20]。本研究通过建立日本血吸虫小鼠感染模型，以期为日本血吸虫感染的相关研究提供参考，为最终了解日本血吸虫与机体免疫反应的互动规律、探索新的诊断和治疗方法提供有益的借鉴。

参考文献

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[基金项目]湖南省教育厅科学研究项目（18B588，19C1832，19C1827，20C1837）；湖南省自然科学基金项目（2022JJ50286）