碱消化-液-液提取LC-MS/MS测定毛发中Δ9-四氢大麻酚

碱消化-液-液提取LC-MS/MS测定毛发中Δ9-四氢大麻酚

朱杨

上海科翎检验技术有限公司

摘要：目的：建立一种毛发中Δ9-四氢大麻酚的的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）的检测方法。方法：洗涤后的毛发通过1mL4%的氢氧化钠溶液水解，在PH3～4条件下，用2mL氯仿：异丙醇（9:1）提取两次，合并两次提取液，于60℃空气流下吹干。残留物用100μL甲醇溶解，采用LC-MS/MS多反应监测模式对Δ9-四氢大麻酚进行定性定量分析。结果：该方法对毛发中Δ9-四氢大麻酚的线性范围为0.05~5.0ng/mg（r=0.997），检出限和定量限皆为0.05ng/mg，日内精密度和日间精密度分别为4.53%~11.2%、4.23%~10.2%，准确度为90.5%~96.4%。结论：建立的碱消化-液-液提取LC-MS/MS检测方法操作简单，经济实用，成本较低，不需要借助其他特殊的装置就能完成，适用于毛发样品中Δ9-四氢大麻酚的定性定量检测分析。

关键词：毛发；Δ9-四氢大麻酚；液相色谱-串联质谱

2022年6月9日，泰国正式宣布种植和吸食大麻合法化，成为亚洲第一个将大麻合法化的国家。在泰国种植和交易大麻不再是违法行为，并且在产品中Δ9-四氢大麻酚的含量低于0.2%前提下，咖啡厅和餐馆可提供注入大麻的饮食。但在我国早已有法律明确规定Δ9-四氢大麻酚是毒品的一种，是“麻醉药品品种目录（2013版）、精神药品品种目录（2013版）”的物质之一，属于限制类精神药品[4]。大麻植物中含有400多种化学成分，其中60种可归为大麻素一类。Δ9-四氢大麻酚仅仅是大麻素的一种，但它是大麻中对大脑影响最大的化学物质[1-3]。主要来源于大麻的叶和茎以及雌性的花朵。摄入此物质使人出现躁动不安、惊恐、头晕麻痹，并伴有错觉、幻觉等症状，长期吸食会产生心理和精神上的双重依赖，造成严重社会危害[5-6]。为有效监控大麻的滥用人群，将社会危害降低，我国加大了对大麻滥用的监测工作力度，开发了毛发中Δ9-四氢大麻酚的检测工作。与血液、尿液等生物检材相比，毛发样品（包括头发、腋毛、阴毛等）具有易采集、易保存、可重复取样等优点。同时毛发检材还有其更为突出的优势，由于毒品原体及其代谢产物会被毛发中的角质蛋白固定，使其可以在毛发中积聚，通过检测毛发可以判断涉毒人员数月乃至数年内是否吸食过毒品。因此，以毛发作为检材可以有效地监测被鉴定人是否滥用过大麻物质。

Δ9-四氢大麻酚进入毛发的程度与药物和黑色素的亲和力以及药物的亲脂性密切相关，Δ9-四氢大麻酚与黑色素无亲和力，并且Δ9-四氢大麻酚为中性化合物，导致其难以进入毛发[7]。同时由于其亲脂性强，所以从生物基质中很难分离。毛发检材采用甲醇超声提取、酸水解或酶水解方法都不足以提取目标物[8]。本文采用碱消化-液-液提取法对人体毛发中Δ9-四氢大麻酚进行提取，通过液相色谱-串联质谱法进行测定，并应用于实际案件中。

1 材料与方法

1.1仪器

液相色谱-串联质谱联用仪(SHIMADZU LC-MS/MS 8060)，十万分之一电子天平（SHIMADZU AUW220D），离心机（金坛市科析仪器有限公司），恒温水浴锅（常州普天仪器制造有限公司）。

1.2试剂

Δ9-四氢大麻酚（THC）1mg/mL（美国cerilliant公司）。

甲酸、丙酮、乙醚、氯仿、异丙醇、乙酸乙酯、正己烷（AR，国药集团化学试剂有限公司）；乙酸铵（色谱纯，国药集团化学试剂有限公司）；乙腈、甲醇（HPLC，ANPEL）

用甲醇稀释配备工作溶液（0.025、0.05、0.1、0.2、0.25、1.0μg/mL）。工作溶液用于工作曲线和质量控制样品的制备。

1.3 仪器条件

1.3.1色谱条件

色谱柱为Restek Allure® PFP Propyl（100mm×2.1mm, 5µm），柱温40℃。采用梯度洗脱。流动相A为含20mmol/L乙酸铵和0.1%甲酸缓冲液，流动相B为乙腈。流速设置为0.3mL/min，进样体积为10μL。梯度洗脱程序如表1所示。

表1 梯度洗脱

1.3.2质谱条件

离子源：电喷雾电离-正离子模式(ESI+)； 检测方式：多反应监测(MRM)；

离子源电压(IS)：5500V； 碰撞气(CAD)、气帘气(CUR)、雾化气(GS1)、辅助气(GS2)均为高纯氮气；离子源温度（TEM）：400℃；碰撞气氦气（CID）：230kpa；干燥气：10L/min；雾化气：3L/min；加热气：10L/min；DL温度：250℃。MRM参数见表2。

表2 Δ9-四氢大麻酚的MRM检测参数及保留时间

1.4 样品处理

毛发样本依次用约10mL的水和丙酮各清洗两次，晾干后剪成约1mm段。

称取50mg剪碎的毛发样本置于10mL的具塞离心管中，加入1mL4%的氢氧化钠溶液，置其于80℃水浴锅中水解15min。取出后放入水中冷却至室温后，加入0.5mL冰醋酸调至PH3～4，用2mL氯仿：异丙醇（9:1）提取两次，合并提取液，于60℃空气流下吹干。残留物用100μL甲醇溶解，进样10μL供LC-MS/MS分析。

2 结果与讨论

2.1 前处理的优化

2.1.1水解时间对提取率的影响

称取50mg剪碎的空白毛发样本置于10mL的具塞离心管中，加入0.25ug/mL的Δ9-四氢大麻酚标准溶液100μL，然后加入1mL4%的氢氧化钠溶液，置其于80℃水浴锅中，分别水解10min、15min、20min、25min、30min，以下同“1.4项”下操作。实验结果表明：10min时，毛发样本还未完全水解，15～20min提取率相对保持稳定，25min以后，提取率下降，部分Δ9-四氢大麻酚发生分解。故选择15min作为水解时间。

2.1.2提取溶剂对提取率的影响

称取剪碎的空白毛发样本50mg，加入100μL0.25ug/mL的Δ9-四氢大麻酚标准溶液，分别取2mL的正己烷：乙酸乙酯（9：1）、乙醚、氯仿：异丙醇（9:1）作为提取溶剂，其余步骤按“1.4项”方法处理样品。实验结果发现：Δ9-四氢大麻酚都可以与基体干扰分离，乙醚的提取效率最低，正己烷：乙酸乙酯（9：1）与氯仿：异丙醇（9:1）的提取效果无明显差异。实验选用氯仿：异丙醇（9:1）作为提取溶剂。

2.1.3提取溶剂的提取次数对提取率的影响

称取剪碎的空白毛发样本50mg，加入100μL0.25ug/mL的Δ9-四氢大麻酚标准溶液，以2mL氯仿：异丙醇（9:1）作为提取溶剂，分别提取1、2、3、4次，合并提取液，其余步骤按“1.4项”方法处理样品。实验结果表明：随着提取次数的增加，提取效果明显增加，2次之后，提取效率增幅不大。故选择2次作为提取次数。

2.1.4提取条件PH值对提取率的影响

称取剪碎的空白毛发样本50mg，加入100μL0.25ug/mL的Δ9-四氢大麻酚标准溶液，80℃水浴中水解15min。取出，冷却至室温后，调节PH分别至1~2、3~4、5~6、7~8，其余步骤按“1.4项”方法处理样品。实验结果发现：PH3~4效果最佳。

2.2 方法学验证

2.2.1 选择性

选择10位从未接触过毒品的志愿者毛发样本经过前处理分析后，通过观察10组样品的色谱出峰情况，在Δ9-四氢大麻酚保留时间区域不存在内源性物质的干扰。

2.2.2 检出限和定量限

采用逐级稀释降低加标浓度，向空白毛发样本中添加加标液的方法来确定检出限和定量限。以信噪比大于等于3（S/N≥3）的Δ9-四氢大麻酚最低浓度作为检出限，以信噪比大于等于10（S/N≥10）的Δ9-四氢大麻酚最低浓度作为作为定量限。得到Δ9-四氢大麻酚的检出限和定量限均能达到0.05ng/mg，可以满足实践工作鉴定的需要。

2.2.3 线性关系

将不同量的Δ9-四氢大麻酚对照溶液添加于50mg的空白毛发中，配制质量浓度分别为0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0ng/mg的样本，按“1.4项”方法处理后进样，以目标物的质量浓度(x，ng/mg）为横坐标，Δ9-四氢大麻酚定量离子对色谱峰峰面积（Y）为纵坐标制作工作曲线，得到工作曲线的线性回归方程Y=0.3615X-0.0012，r=0.997。

2.2.4 精密度和准确度

将不同量的Δ9-四氢大麻酚对照溶液添加于50mg的空白毛发中，分别配制成0.25、1.0、5.0ng/mg的3组毛发样本，每个浓度点样本配制3个平行的质控样，按“1.4项”方法处理后进样，得到分析值。以每个质量浓度点分析值的RSD作为日内精密度，同样步骤连续进行5天，计算日间精密度。以每个浓度点样品分析值的平均值与理论值的百分比为准确度。表3所示，方法日内精密度和日间精密度分别为4.53%~11.2%、4.23%~10.2%，准确度为90.5%~96.4%，能够满足检测的需要。

表3 Δ9-四氢大麻酚（THC）的精密度、准确度、回收率和基质效应

2.2.5 基质效应、提取回收率

基质效应是样品基质中固有的分子随目标分析物共同流出进入质谱检测时，其对目标分析物的离子化过程产生抑制或增强的现象。提取回收率与基质效应可同时考察，分别配制0.25、1.0、5.0ng/mg的3组毛发样品，每个浓度点配制6个平行的质控样，按“1.4项”方法处理后进样分析得到的每个质量浓度点定量离子对色谱峰峰面积的平均值设为A，不同来源的空白毛发按“1.4项”方法处理后添加对应浓度的标准物质进样后测得的定量离子对色谱峰峰面积平均值设为B，对照标准物质溶液直接进样后测得的定量离子对色谱峰峰面积平均值设为C。基质效应(%)=（B/C-1）*100，提取回收率（%）=A/B*100。表3所示，提取回收率为60.2%~65.3%，基质效应为8.52%~10.2%，结果满足实验要求。

2.3 案例应用

2021年6月某日，某派出所民警夜间路边巡逻期间，发现一男子在路上行走摇摆不定，犹如醉酒，民警担心男子安全，上前察看，发现该男子浑身颤抖、谈话间语无伦次，眼神躲闪。经审讯，怀疑该男子有吸毒嫌疑，遂将其带至我单位进行毒品鉴定。遂对该男子头顶后部贴跟剪取头发，经本方法前处理分析，在该男子毛发中检出Δ9-四氢大麻酚成分，质量浓度为0.52ng/mg，说明其在近3个月内多次滥用Δ9-四氢大麻酚毒品。

3. 结论

本文采用了碱消化-液-液提取法，建立了毛发中Δ9-四氢大麻酚的LC-MS/MS检测方法。该提取方法操作便捷，无繁琐的步骤，节约了前处理的时间，同时也不需要借助其他辅助的仪器设备就能完成，可以有目的性、有选择性的将目标物从繁杂的内源性杂质中提取分离出来，适用于毛发样品中Δ9-四氢大麻酚的定性定量检测分析。

参考文献：

[1]吴筠,吴侔天.11-羟基-Δ9-四氢大麻酚二酸的定量分析[J].中国运动医学杂志,2004,23(1):101-103.

[2]PERTWEERG.Handbook of Cannabis [M].UK:Oxford University Press,2014:13-17.

[3]ELSOHLY MA,SLADED.Chemical constituents of marijuana: the complex mixture of natural cannabinoids[J].Life Sci,2005,78(5):539-548.

[4]唐慧娟,臧巩固,程超华,等.工业大麻产量和品质性状的对应分析[J].作物杂志,2018(2):20-24.

[5]严江涛,常丽,张江江,等.工业大麻中大麻二酚提取工艺优化和生物活性分析[J].中国麻业科学,2020,42(2):61-69.

[6]范佳玉,李俊旭,张汉霆,等.大麻的成瘾性和潜在的药用价值[J].中国药物依赖性杂志,2017,26（5）:330~336.

[7]沈敏,向平,施研等.毛发分析基础及应用[M].第二版.北京:科学出版社,2020.329.

[8]沈敏,向平,严慧等.滥用物质分析与应用[M].北京:科学出版社,2016.229.