5-FU对肝癌细胞HepG2增殖的影响

5- FU 对肝 癌细胞 HepG2 增殖的影响

和婷 王会平 刘冲 董轲

（空军军医大学第二附属医院检验科 陕西 西安 710038）

[摘要] 目的：检测不同浓度5-FU对人肝癌细胞HepG2增殖抑制和克隆形成能力的影响。方法：CCK8实验检测不同浓度5-FU对人肝癌细胞HepG2增殖抑制能力，克隆形成实验检测不同浓度5-FU对HepG2细胞克隆形成能力的影响。利用流式细胞术检测不同浓度5-FU对HepG2细胞凋亡的影响。结果：CCK8和克隆形成结果均显示5-FU可抑制HepG2细胞的增殖，且随着浓度增大抑制效果明显。高浓度5-FU可使HepG2细胞凋亡增加。结论：5-FU对人肝癌细胞HepG2增殖和克隆形成具有较强的抑制作用。

[关键词]：肝癌；5-FU；细胞增殖

前言

肝癌是全世界常见的消化道恶性肿瘤，主要是由肝细胞和肝内胆管上皮细胞发生的恶性肿瘤^[1]，近年来发病率呈上升趋势，具有复发率高，预后不良的特点^[2,3]，目前对肝癌的治疗方法较多，主要为放化疗，生物及中西医结合治疗。5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)是临床常见的化疗药物，通过干扰核酸的合成来抑制肿瘤细胞增殖，是具有细胞周期特异性的细胞毒类抗癌药物^[4]。已在临床使用较长时间，随着临床化疗的进行，出现的副作用也较多^[5]，本实验主要研究在一定剂量范围内，不同浓度5-FU对肝癌细胞增殖的作用机制。

1材料与方法

1.1材料

人肝癌细胞HepG2，为本实验室保存。小牛血清购自杭州四季青公司，DMEM培养液购自Invitrogen公司。CCK8细胞增殖检测试剂盒和细胞周期检测试剂盒购自江苏凯基生物公司。其他生化试剂均为进口或国产分析纯试剂。5-氟尿嘧啶购自天津金耀氨基酸有限公司(批号:1803091)。

1.2仪器

IX71倒置显微镜（日本奥林巴斯株式会社），Epoch超微量分光光度计（美国BIO-TEK公司），Calibur流式细胞仪（美国BD公司）。

1.3 细胞培养

HepG2细胞，含10%小牛血清，1%青/链霉素的高糖DMEM培养液，于37℃、5%CO2培养箱中培养。0.25%的胰酶消化传代。

1.4 CCK-8检测细胞增殖

取对数生长期的HepG2细胞接种，0.25%的胰酶消化，1000rpm，5min离心收集细胞，调整细胞浓度至2×10⁴/mL，接种细胞至96孔板中，100 µL/孔。37℃、5%CO2培养24h，待细胞贴壁后，吸弃培养液，加入含5-FU的DMEM无血清培养液至浓度分别为0，5，15，25，50µg／mL。每组设置6个复孔，分别培养0h，24h，48 h和72h，每孔加入10µL的CCK8，继续培养4h，检测450nm吸光值。相对增殖速率=OD_实验组/OD_对照组×100%。

1.5细胞克隆形成实验

取对数生长期的HepG2细胞，接种200个细胞至10cm培养皿中，37℃、5%CO2培养24h，待细胞贴壁后，吸弃培养液，加入含5-FU的DMEM 10%小牛血清培养液至浓度分别为0，5，15，25，50µg／mL，培养15天，吸弃培养液，PBS洗三次，75%乙醇固定15min，加入1mL结晶紫染液，染色10 min。流水冲洗至背景干净，室温晾干，观察计数。

1.6细胞凋亡检测

接种HepG2细胞至6孔板中，2×10⁵个细胞/孔，37℃、5%CO2培养24h，待细胞贴壁后，吸弃培养液，加入含5-FU的DMEM 10%小牛血清培养液至浓度分别为0，5，15，25，50µg／mL，培养48h后，采用无EDTA的胰酶消化收集细胞，PBS洗涤细胞2次，加入500 L的Binding Buffer重悬细胞，分别加入5 L Annexin V-FITC与5 LPI，混匀，室温避光反应5-15 min，流式细胞仪检测。

1.7 统计学处理

采用SPSS22.0 统计学软件，两组间比较采用独立样本t检验；P < 0.05 表示差异有统计学意义。

2结果

2.1 5-FU对HepG2细胞的生长增殖抑制作用

CCK8细胞增殖实验结果显示随着5-FU浓度增加细胞增殖速率逐渐降低（图1），表明5-FU对HepG2细胞的增殖有抑制作用。

图1 CCK8实验检测细胞增殖能力，* P<0.05

2.25-FU抑制HepG2细胞克隆形成

克隆形成实验结果显示（图2），经过相同条件的培养后，高浓度5-FU的细胞克隆数目低于低浓度5-FU的细胞克隆，表明5-FU对HepG2细胞的增殖有抑制作用。

图2 不同浓度5-FU对细胞克隆形成的影响，*P<0.05

2.3 5-FU对细胞凋亡的作用

流式细胞术分析结果发现（图3）5-FU处理HepG2细胞48 h，可诱导HepG2发生凋亡，凋亡细胞比率随DHA处理浓度的升高而提高。

图3 流式细胞仪检测细胞凋亡

3讨论

肝癌的发生是一个多因素、多步骤的复杂过程，其治疗难度大，预后差，一直是临床上面临的重大难题和挑战。其主要因素是肝癌细胞的侵袭和转移能力^[6]。5-FU作为抗肿瘤药物已广泛应用于各种实体肿瘤的治疗，如大肠癌、胰腺癌、乳腺癌、头颈部肿瘤、胃癌和卵巢癌等，目前已成为消化道恶性肿瘤普遍使用的化疗药物。今年来，随着科研工作的深入研究，其抗肿瘤的机制也备受瞩目。5-FU是抗嘧啶类抗代谢药物，Matheson^[7]在动物体内证明其具有增强NK细胞杀伤肿瘤细胞的能力。郭亚军^[8]等在肝癌小鼠模型中也发现低剂量5-FU能抑制Ts细胞，有利于肿瘤所引起的免疫抑制的解除，与免疫增强剂呈显著协同作用。

当前临床已有很多资料表明，5-FU在杀伤肿瘤细胞的同时也对正常细胞造成损伤，其副作用在临床不可忽视^[9.10]。本课题主要研究体外低剂量5-FU对肝癌细胞HepG2的增殖抑制，发现在一定剂量范围内，随着5-FU浓度的增加，肝癌细胞增殖抑制作用越明显，增殖与剂量呈负相关。课题主要研究体外实验，对于联合药物治疗及体内实验后续会进一步研究，更深入探讨5-FU 的抗肿瘤机制。

参考文献(References)

1. 王惠,徐陆周,吴坚,等.理冲汤加减联合5-氟尿嘧啶对人肝癌细HepG2上皮间质转化的影响[J].中国实验方剂学杂志,2019,25(7):14-21..

2. Venook AP, Papandreou C, Furuse J, de Guevara LL. The incidence and epidemiology of hepatocellular carcinoma: a global and regional perspective. Oncologist. 2010;15 Suppl 4:5-13. doi:10.1634/theoncologist.2010-S4-05.

3. 彭慧,郑莹,彭鹏,等.上海市人群2002-2006年肝癌生存率分析[J].中国癌症杂志,2016,26(7):561-568

4. 唐晓丽,杨霖,杨依,等.5-氟尿嘧啶联合机械划伤致金黄地鼠口腔黏膜炎模型的建立[J].中国比较医学杂志,2019,29(1):29-34

5. 张小年,张洁文,吴绍锋,等.淫羊藿苷对5-氟尿嘧啶诱导的大鼠骨髓间充质干细胞损伤的保护作用[J].中国药理学通报,2020,36(5):675-681

6. 殷晓丽,刘兆玉.上皮间质转化在肿瘤中的研究进展[J].医学综述,2017,23(12):2359-2363,2369

7. Matheson DS, Green B, Hoar DI. The influence of methotrexate and thymidine on the human natural killer cell function in vitro. J Immunol. 1983;131(4):1619-1621.

8. 郭亚军，等．肝癌太鼠T细胞亚群变化和免斑疗法俸内抗 肿瘤作用第二军医大学学报，1988}9(5)t 401~406

9. 赵敬,赵涌.姜黄素对人宫颈癌细胞株HeLa细胞抑制及凋亡的影响[J].重庆医科大学学报,2004,29(3):296-298.

10. 冬毕毕,周军民,陈凯,等.氟尿嘧啶对结肠癌细胞凋亡及Rb蛋白表达的影响.癌症,2000,19(5):439-441