微生物发酵生产脂肪酶的研究

微生物发酵生产脂肪酶的研究

黄海

河南牧业经济学院单位 河南郑州  450000

　　摘 要：脂肪酶是一种重要的工业用酶, 广泛应用于食品、精细化工、医药和能源等领域。脂肪酶最主要的来源是通过微生物发酵生产。酶的开发和应用具有巨大市场前景。一般情况下酶被利用在日常食品的发酵，以及洗涤剂、制药等新的领域的应用，同时因为酶的重要性脂肪酶也受到广泛关注。市场对脂肪酶的需求不断增长，从而使对于生产脂肪酶的研究也在不断的提高，现在的市场上较多情况都是利用微生物的发酵来制造和生产脂肪酶。但是由于目前商业化的脂肪酶成本相对较高，因此探索如何去提高脂肪酶的产量以及利用率是目前需要解决的问题。我们通过研究发现传统的发酵培养技术降低了脂肪酶的生产成本，同时可以很好的提高生产脂肪酶的效率。

关键词：脂肪酶;微生物;发酵

作为重要的工业用酶, 广泛应用于食品、制革、饲料、洗涤、油酯化工等传统工业领域。1984 年, Zaks 和 Klibano在有机溶剂体系中, 以脂肪酶粉为催化剂, 成功地催化合成了一系列有机化合物。该研究揭开了非水相酶学的研究序幕, 并迅速成为应用酶学研究中最为活跃、发展最为迅速的领域。脂肪酶是非水相酶学中最为重要的一类酶。显著不同于在水相体系中的水解反应特性, 脂肪酶在非水相体系中具有良好的酯化、转酯、醇解和胺解等特性。该特性使脂肪酶可被广泛地应用于生物能源( 生物柴油) 、药物合成等应用前景广阔的领域。脂肪酶广泛存在动物、植物和微生物中。动物体内含脂肪酶较多的是高等动物的胰脏和脂肪组织等, 而植物中含脂肪酶较多的是油料作物的种子。而微生物脂肪酶种类最多, 广泛存在于细菌、酵母和霉菌中, 最易获得和大规模生产, 且具有比动植物脂肪酶更广的pH、温度适应性, 因此是工业用脂肪酶的重要来源。自20世纪初首次发现以来, 便得到广泛研究和应用。近20年来, 微生物脂肪酶发酵研究主要集中在高产菌株的筛选、常规诱变育种、基因工程菌的构建、发酵工艺条件优化、发酵工艺放大和酶的分离纯化等方面, 其中脂肪酶工程化技术的研究是其能否实现工业化生产的关键。

　　一、什么是脂肪酶以及脂肪酶如何生产

（1）脂肪酶( EC 3.1.1.3) , 又称三酰甘油酰基水解酶。在传统酶学中, 脂肪酶是一类水解长链脂肪酸甘油酯生成游离脂肪酸和甘油的界面酶。能够催化油脂发生水解反应，生成脂肪酸和甘油等物质。脂肪酶是酶类的一种，其本质是由氨基酸组成的蛋白质物质，由于脂肪酶有专一性，所以只对一种脂肪起作用，不同结构的脂肪酶其可以发生作用的油脂类物质也不同。脂肪酶最早于1834年被发现，是生物体内极其重要的代谢酶，是人体和生物体代谢过程中不可缺少的酶类。有了脂肪酶，人体和生物体摄入的油脂类物质才能被肠道吸收。随着时代的发展，脂肪酶也逐渐被应用在工业上。尽管产脂肪酶的微生物分布广泛, 但寻找适于工业生产的脂肪酶产生菌却比较困难。Fagery 认为优良产酶菌株的标准应是发酵周期短、营养基质低廉、菌株易分离、胞外酶、非致病菌、不产生毒素、遗传性状稳定及对噬菌体不敏感等。脂肪酶产量不仅可以通过菌种改良( 包括传统育种和基因工程菌的构建) , 而且还可以通过对发酵条件优化来提高。同样的菌种, 不同的发酵条件可能会对产酶量产生巨大的差异。因此, 发酵条件的优化和发酵调控策略对脂肪酶的工业化生产具有重要的意义。

适当而丰富的营养物是菌体生长和酶大量 产生的重要前提。由于脂肪酶产生菌和酶特性的不同, 培养基配比和培养条件也各不相同。培养基一般由碳源、氮源诱导物及常见的无机盐等组成。常见碳源包括油脂、可溶性淀粉、玉米粉、葡萄糖、果搪、糊精、糖蜜、麦麸和小麦粉等; 速效碳源如葡萄糖、蔗糖、麦芽糖等有利于细菌脂肪酶的形成,而缓效碳源如玉米粉和小麦粉等则有利于真菌脂肪酶的形成。也有报道指出, 当培养基中含有单糖、双糖和甘油, 能抑制脂肪酶产生。氮源分为无机氮源( 硫酸铵、硝酸铵、尿素等) 、有机氮源( 如大豆粉、玉米浆、蛋白胨、酪蛋白等) 和复合氮源。一般认为复合氮源对微生物生长及产酶效果较好。有机氮源一般比无机氮源要好, 如蛋白胨和酵母膏在细菌脂肪酶的生产中应用十分广泛。但有些文献报道 NH4Cl 和( NH4) 2 HPO4 等无机氮源也在部分微生物的脂肪酶生产中有较好的效果。微量元素和某些添加物对发酵产酶也会产 生重要影响。Rashid 的研究表明添加 EDTA 于反应体系中能完全抑制适冷 假 单 胞 菌 KB700A 所 产 的 低温脂肪酶的活力, 而添加 Ca2+能显著提高酶活。此外, Ca2+和 Mg2+能促进脂肪酶的分泌[21, 22]。大多数微生物只有诱导物存在时才能产生 脂肪酶。诱导物可以是甘油三酯、长链脂肪酸、脂肪酸酯及其表面活性剂。许多研究表明培养基中添加表面活性剂如 Tween 80、Triton X-100、SDS、PEG 和阿拉伯胶等可以不同程度地提高脂肪酶的产量。表面活性剂促进产酶主要是由于增加细胞的通透性,使脂肪酶易于分泌到胞外。Corzo 等报道 Tween 80的浓度在 0.5g/L 到 2g/L 时能增加胞外脂肪酶活性而不改变生物量浓度, 油酸强烈抑制脂肪酶活性。添 加 0.5%的 Triton X-100 能 使 Aspergillus niger 突变菌株产酶量提高 1.6 倍。阴离子表面活性剂 SDS( 10mmol/L) 能使脂肪酶的催化活性提高 25.5%。

2. 通常情况下我们会利用的脂肪酶主要来源于微生物的发酵。产脂肪酶的菌类主要有黑曲霉菌、荧光假单胞菌、白地霉无根根霉菌、毛霉圆柱假丝酵母菌、巢子须霉德氏根霉菌、多球菌绵毛状腐质霉菌、圆弧青霉黏质色杆菌。而国内用于生产提取脂肪酶的菌种以黑曲霉为主，采用液体深层发酵的方法。脂肪酶发酵菌还用于工业生产，其产量和产酶质量必然是各大生产厂家最关注的问题。因此科研人员采用诱变技术对脂肪酶不断作用引起其基因突变并且一步一步进行筛选，最终得出可以用于工业生产的高产菌株。高产菌株的产酶能力是一般菌株的几十倍甚至上百倍。富集培养基用于增加所采集样本中微生物的数量，以避免把某些微生物漏掉，所以通常用全营养培养基。初筛培养基用于把不产目标产物的微生物去掉，把产生目标产物的微生物挑选出来，所以一般要用目标产物的底物作该类物质的唯一来源。例如，如果筛选产纤维素酶的微生物，就在初筛时，用纤维素作唯一碳源;如果筛选产菊糖酶的微生物，就用菊粉为唯一碳源。这样一来，不能产生目标产物的微生物就无法生长，而能够生长的一定是能够产生目标产物的微生物。复筛培养基的作用是挑选出高产菌株，有时，还附带确定初步的产物产生条件。仍以纤维素酶产生菌为例，培养基用纤维素为唯一碳源，制平板，微生物生长后，看透明圈，直径越大，产生的酶就越多（或酶活力越高）。挑选出高产菌株，用液体培养，取样测酶活力，再次挑选出高产菌株。用正交试验初步确定产酶条件。基本上一支菌种就这样筛选出来了。当然，实际情况可能复杂得多，如筛选不到想要的微生物、产物存在，但活性太低，没有实用价值等等。反正若是想得到一支好的微生物菌种着实不易。

　　二、如何提高脂肪酶的产量

　　（1）我们都知道，脂肪酶是一种活性很大的物质，而其生物分类属于蛋白质类有机物。因此，我们可以通过对比蛋白质类似物质来发现如何提高脂肪酶的产量。通过研究发现脂肪酶的活性主要是受到脂肪酶所处的具体环境影响，如温度等因素，所以我们可以通过观察酶的所处的环境来确定脂肪酶的活性是否受其影响。除此之外，在使用微生物生产脂肪酶的过程中一定要确保在生产的环境中是否有其他的微生物抑制剂，从而使生产出来的脂肪酶的纯度达到要求的高度。优良的生物产品从实验室水平到工业化生 产首先要解决的问题是生物过程的优化。工业发酵过程中, 设计一个发酵培养基是至关重要的。培养基的组成显著影响产品浓度、产量和效率; 在商业化生产中, 培养基成本能显著影响总生产成本。优化培养基涉及大量的实验研究, 是一个耗时、耗力、耗费的过程。影响发酵过程的因素有很多, 主要包括培养基组成、接种量、种龄、培养温度、转速、装液量、发酵周期、溶氧、pH 值和通气条件等, 这些因素往往又不是独立影响发酵过程的, 常常是交互作用。除传统的单因子法、正交设计法在生物过程优化中得到广泛应用外, 响应面法、均匀设计法、人工神经网络、模糊逻辑控制、专家系统、遗传算法和化学计量分析等一批更有效的新方法也在发酵培养基的优化及过程程控制中逐步得到推广应用, 并日益显示出优越性。其中响应面法应用最广, 一般可以将脂肪酶产量提高 1～10 倍, 最高可达 12 倍。

　　（2）根据脂肪酶的特性可以得出影响微生物发酵脂肪酶的产量的因素，即可以从脂肪酶菌株的改造、脂肪酶基因的改良、脂肪酶发酵工程和脂肪酶后期处理等四个方面来提高微生物脂肪酶产量。众所周知，脂肪酶基因的改良是最直接的一个办法，而脂肪酶基因的稳定性则是需要对脂肪酶改良的一个性质。而对另外两个因素脂肪酶发酵工程和脂肪酶后期处理来说，同样可以很好的增强脂肪酶的产量，通过对脂肪酶的后期处理可以提高脂肪酶在微生物发酵之后的利用率。我们通过研究发现传统的发酵培养技术降低了脂肪酶的生产成本，同时可以很好的提高生产脂肪酶的效率。

（3）除此之外，我们希望通过提高脂肪酶的产量和利用率来为微生物发酵生产脂肪酶的工业生产上提高更好的方法。所以我们提高调查发现细菌、真菌的存在对于脂肪酶的含量有着很大的影响，所以说这同样也是一个提高脂肪酶产量的重要因素。可以在适宜微生物生长的PH环境下，加入一些细菌、真菌，从而提高脂肪酶的产量。同时因为细菌、真菌比较容易培养，在现实生产中也比较容易获取。因此我们希望使用在微生物生产脂肪酶的过程中添加细菌、真菌等来提高脂肪酶的产量，而这种改良的方法生产出来的脂肪酶也适合于工业的生产，同时也更容易获得高纯度的脂肪酶样品。

酶的开发和应用具有巨大市场前景。2004年全球工业用酶产值达 20 亿美元, 年平均增长率 4%～5%, 预计到 2009 年将达到 24 亿美元。脂肪酶不仅在食品加工、洗涤剂、制药、精细化工、有机合成和脱脂等传统工业应用日益广泛, 而且还在生物传感器、诊断工具酶、生物柴油合成等新领域的应用也受到广泛关注。市场对脂肪酶的需求不断增长,使得脂肪酶的研究方向由发掘新的脂肪酶逐渐转向提高现有脂肪酶性能以满足市场的需求。由于目前商业化的脂肪酶成本相对较高, 使得脂肪酶在更大范围的应用受到一定限制, 因此通过发酵工程技术提高脂肪酶的生产力是一个非常迫切的工作。另外, 探索新型固定化技术以提高脂肪酶利用率, 采用全细胞催化和表面展示技术降低发酵成本等方面的研究越来越受到研究人员的重视。传统的发酵培养技术及细胞固定化方法、高效基因工程菌、高密度发酵等新技术手段在脂肪酶发酵生产方面的成功运用, 降低了脂肪酶的生产成本, 加速了脂肪酶产品工业化进程, 拓宽了脂肪酶的应用范围。随着发酵控制和检测技术的发展, 脂肪酶的产量还将进一步提高, 脂肪酶产品的成本也将逐渐降低, 其应用范围也将越来越广泛。

　　三、结语

　　综上所述，脂肪酶是酶类的一种，可以进行水解反应以及酯化反应。而其本质是由氨基酸组成的蛋白质物质。因为脂肪酶属于蛋白质的一种，我们可以通过对比蛋白质类似物质来发现如何提高脂肪酶的产量。通過研究发现脂肪酶的活性主要是受到脂肪酶所处的具体环境影响，如温度等因素。通过使用高产的菌株来进行生产脂肪酶，其产酶能力是一般菌株的几十倍甚至上百倍。在富集培养基用于增加所采集样本中微生物的数量，以避免把某些微生物漏掉，所以通常用全营养培养基。脂肪酶在微生物中有广泛的分布，其产生菌主要是霉菌和细菌。我们通过研究发现传统的发酵培养技术降低了脂肪酶的生产成本，同时可以很好的去提高生产脂肪酶的效率。最后，我们希望通过提高脂肪酶的产量和利用率来为微生物脂肪酶的规模化工业生产提供方法性指导。

　　参考文献：

　　[1]赖红星.白地霉脂肪酶基因的异源表达与定向进化[D].中国农业科学院，2010.

　　[2]孙国政.甘肃牧区产脂肪酶微生物的筛选、培养条件和酶学性质的研究[D].甘肃农业大学，2010.

[3]汪小锋，王俊，杨江科，闫云君.微生物发酵生产脂肪酶的研究进展[J].生物技术通报，2008（04）：47-53.

作者简介：黄海，（1989-10），男，汉族，河南南阳人，河南牧业经济学院单位助教职务，硕士学历,研究方向：微生物发酵