新型冠状病毒样品混合提取对核酸检测结果的探讨

新型冠状病毒样品混合提取对核酸检测结果的探讨

朱中华 张茂海 曹祥燎 朱凌云

大冶市人民医院 湖北大冶 435100

摘要 目的 了解新型冠状病毒样品混合提取对核酸检测结果的影响，探讨在日常检测工作中进行样品混合提取核酸的可行性。 方 法　将第三方阳性质控品单份（1组）与新型冠状病毒咽拭子阴性样品单份进行两两加样混提即2组、3组，用实时荧光RT—PCR技术检测原液和混合ORF-1ab基因和N基因，对三组进行数据分析。结果　1组与2组、3组对ORF-1ab基因和N基因相比，Ｐ值均大于0.05，无统计学意义　结论　2份样本混合提取对西安天隆磁珠法核酸提取试剂盒检测2019-nCoV是可行的，适合在日常工作中应用。

关键词 新型冠状病毒 核酸检测 混合提取 RT-PCR

为探讨新型冠状病毒样品双份混合提取对核酸检测结果的可行性，本研究将第三方阳性质控品（按不同比例进行稀释）单份（1组 200μL）与新型冠状病毒咽拭子阴性样品单份进行两两加样混提即2组（一份阴性+一份阳性质控品 400μL）、3组（一份阳性质控品+一份阳性质控品 400μL），先后分别加样200μL到同一个检测孔进行核酸提取，再按试剂说明书进行上机扩增，对其扩增结果进行比对分析来探讨其可行性。

1材料与方法

1. 1. 材料 选取第三方阳性质控品（广州邦德盛生物科技有限公司，批号2021006 S2中值、非定值）按不同的比例进行稀释后的样本4份，选取4份阴性咽拭子作为混提样本。

   2. 试剂和设备 核酸提取仪，荧光定量PCR仪，核酸提取试剂盒（西安天隆科技有限公司配套产品）,荧光定量PCR试剂盒（圣湘生物科技股份有限公司，批号2021086）

   3. 混提方法 按照西安天隆核酸提取或纯化试剂使用说明书，将稀释后的阳性样品和阴性样品进行分别加入到核酸提取试剂（每次加样200μL样品），另外按阴性和稀释后阳性品两两分别加样，分别加入到同一个核酸提取孔中，进行上进提取核酸，所有标本均重复操作上机检测两次，检测Ct值结果取均㨁。

   4. 检测方法 按照圣湘生物新型冠状病毒（2019-nCcV）核酸检测试剂盒说明书报告阴阳性。

   5. 1.5 统计学分析 采用SPSS18.0软件，对1组、2 组、3组圹增后的Ct值进行比对分析。

2 结果

2.1 不同样本组的核酸检测的CT值（表1） 对于阴性样品，一个提取孔加入200μL和一个提取孔加入400μL的20个样品2019-nCoV结果都是阴性，对于阳性质控品，1组、2组、3组的2019-nCoV结果都是阳性的；但1组、2组的CT值均值与3组的ORF-1ab基因和N基因CT值均值差分别在1.3和1.8左右。

2.2 运用SPSS软件对1组与2组、3组的ORF-1ab和N基因进行分析，P=0.809、0.914和0.099、0.063，均大于0.05，没有统计学意义，说明1组单个提与2组、3组混提对ORF-1ab和N基因检测不存在区别。

3讨论

样本混合检测国家推荐的有两种方式，即单人份采样，再将多份样本进行混合加样检测，即混检模式；两者都是为了提高检测效率。混检模式在实验室操作比较繁琐，多次加样混匀，容易造成实验室污染^【1】，混采模式适用于大规模人群检测，在医院的发热病人和患者检测并不适用。本研究在核酸提取加样的的过程中将原说明书一份样品的200μL的量增加到两个样品各200μL，其他程序均不变，相当于两批的样品，加样的时间不变，核酸提取的时间和扩增的时间减半，提高了检测效率，与混采模式相比，不需要混合采样，发现阳性时不需要重新采样送检；与混检模式相比，不需要将样品加入到分管混匀后再加入到提取孔中，样品不会被稀释，检测的灵敏度不会下降。

影响核酸提取效率的关键因素包括上样量、模板洗脱体积、裂解时间、洗涤和洗脱时间^【2.3】。本研究.3组的样品量与1组的样品量多了200μL，由于是采用的天隆的磁珠法核酸提取试剂盒，受模板样品孔的大小所限，样品量过大，在提取过程中会导致样本外溢，导致核酸提取仪、标本被污染导致假阳性。400μL的加样量正好合适。提取量的大小与初始病毒载量吴正相关^【4】 ，3组与1组、2组相比，病毒载量多一倍，ORF-1ab基因和N基因CT值均值分别下降了1.3和1.8左右。

本研究采用的第三方均值为1.73*10⁴ copies/ml阳性质控品替代阳性样本，3组与1组、2组相比两个基因的检测CT值均下降了1.5左右，无统计学意义，说明了各加入两份阳性质控品200μL混提核酸检测是可行的。但值得注意的是：本研究采用的是阳性质控品替代阳性样本，未考虑到样本间的相互干扰与抑制，同时采用的是均值是1.73*10⁴ copies/ml质控，两份样品所含的核酸能被全部提取，如果样品含量病毒量足够大，会不会出现抑制现象。

表1 不同样本组的核酸检测的CT值

综上所述，本研究2份样本混合提取对西安天隆磁珠法核酸提取试剂盒检测2019-nCoV是可行的，适合在日常工作中应用，降低检测成本，提高工作效率.

　参与文献

1.闫颖 常乐 姬慧敏等 新型冠状病毒核酸混采对检测结果的影响中华检验医学杂志 2021， 44 （5）：388-393.

2.王成彬 王辉 等2019新型冠状病毒肺炎临床实验室生物安全防护专家共识 中华检验医学杂志 2020 ，43 （3）：203-208.

3.里进, 叶光明, 陈良君, 等 . 新型冠状病毒核酸检测假阴性结果原因分析及对策[J]. 中华检验医学杂志, 2020, 43(3): 221‐225.

4.吴永彬、万 颖、,蒋红玲、,张 晶、辛 杰 新型冠状病毒核酸提取方法的性能评价及临床应用 检验医学与临床2021，18（6）：727-728.