浅谈PFGE实验及注意问题

浅谈 PFGE实验及注意问题

董桂花，韩冰，焦宪军

济南市 章丘区 疾病预防控制中心微生物 检验科

山东 济南章丘 250200

摘要：目的 为达到 PulseNet China 网络实验室监测技术能力标准化和规范化，实现数据有效传输和分析，要求PFGE实验完成的图像要符合质量标准。方法 按照国家疾控中心出台的标准操作规程及结合各网络实验室开展实验以来积累的操作经验。结果 PFGE实验按操作规程认真、仔细操作，完成的图像就能够达到质量标准。

关键词：PFGE实验 ；操作规程 ；注意问题

中图分类号：R-331 文献标识码：B

PFGE（Pulsed Field Gel Electrophoresis）即脉冲场凝胶电泳。为达到 PulseNet China 网络实验室监测技术能力标准化和规范化，实现数据有效传输和分析，要求PFGE实验完成的图像要符合质量标准。PFGE实验操作步骤繁杂，耗费时间长，要取得标准的分子分型条带，每一步骤均得按操作规程认真操作，同时还得结合操作经验。PFGE实验主要包括以下步骤：实验前准备工作；细菌培养；制备小胶块；胶块裂解；胶块清洗；酶切；电泳；染色、脱色，读胶成像，现将每一步操作及注意问题简述如下。

1. PFGE实验前准备工作。

1.1制备灭菌纯水：实验用水为水质达到 18.2M 欧的纯水。所用耗材高压灭菌：配置试剂用螺口瓶，小试管，量筒，枪头。

1.2配制试验用试剂：严格按照操作规程进行配制。所用试剂有Tris:EDTA Buffer (TE), pH 8.0；Cell Suspension Buffer (CSB)；Cell Lysis Buffer（CLB）；0.5×TBE Buffer ；琼脂糖凝胶块(1%SeaKem Gold，以TE 配制)；电泳胶(1% SeaKem Gold，以 0.5×TBE 配制)。

2. 细菌培养。

2.1如果是冷冻保存的菌株，要复苏后再转种一次，保持该菌株的活力。PFGE实验用菌株要求在该菌株最佳培养条件下培养14-18小时。

2.2 PFGE实验用菌株是已经被鉴定至种的纯菌株。

2.3同时接种标准菌株 H9812，（该菌株是 PulseNet China 做 PFGE 分析使用的标准株，为沙门菌 Braenderup 血清型），36℃±1℃培养 14～18 小时。

2.4注意问题：一定把标准菌株和待测菌株一同分离培养。

3、小胶块的制备。

3.1制备菌悬液:取灭菌小试管加入1ml细胞悬浊液，用无菌棉拭子从培养皿上刮取细菌，轻旋棉签使菌悬液均匀。通过增加CSB和增加菌量，用比浊仪调整其菌悬液的麦氏浊度在规定的单位值范围内。注意问题：菌悬液一定要混匀。

3.1.1刮取细菌混匀时要轻柔，减少气溶胶发生。

3.1.2不同厂家比浊仪和小试管对浊度都有影响，每个实验室要建立相应的浊度范围。

3.1.3革兰氏阳性菌制备菌悬液时要加入溶菌酶裂解，不同细菌溶菌酶加入的量不同，按操作规程加入。金黄色葡萄球菌裂解使用溶葡萄球菌酶，其余革兰氏阳性菌裂解均使用普通溶菌酶。

3.2小胶块的制备

3.2.1取1.5ml无菌微量离心管，做好标记。加入已制备好的菌悬液400ul。如果菌悬液是冷藏的，要将加好菌悬液的微量离心管在37℃水浴中孵育5分钟。革兰氏阳性菌直接使用溶菌酶裂解后的菌悬液。

3.2.2在上述微量离心管中加入20ul的蛋白酶K(20mg/ml)，轻轻混匀。操作中蛋白酶K要置于冰盒上。注意问题：购买的蛋白酶K为粉末状，配制成20mg/ml溶液后分装至离心管中，每管500ul，置-20℃保存。每次用一支，不可反复冻融，用完后丢弃。

3.2.3在微量离心管中加入与菌悬液等量的1% SeaKem Gold:1%SDS，用枪头轻轻吹吸几次混匀，将混合物加入模具相应加样孔，避免气泡产生。室温下凝固15分钟，或4℃冰箱中凝固5分钟。注意问题：1% SeaKem Gold:1%SDS加入前已配制好，一直放置于54℃水浴摇床中，避免其凝固。

4、胶块裂解

4.1取50ml螺帽管，做好标记，加入5mlCLB液，再加入蛋白酶K(20mg/ml)25ul，混匀。把凝固的小胶块移入相应螺帽管中。注意问题：胶块要浸在液面下面，不能贴在管壁上。

4.2将螺帽管放于54℃水浴摇床孵育2小时，转速为150-170rpm。摇床水浴液面要高于螺帽管中CLB液面。注意问题：不同细菌，裂解孵育时间及转速不同，按操作规程操作或各实验室按照自己操作经验掌握的孵育时间进行裂解。

4.3将TE液，灭菌纯水放置50℃水浴或温箱中预热。注意问题：一定记着放置预热，以免耽误清洗胶块。

5. 胶块清洗

5.1调节水浴摇床温度为50℃。

5.2裂解结束，取出螺帽管，换上绿色滤帽，轻轻倒掉CLB液并将螺帽管置于吸水纸上，使管内液体尽量排除干净。将螺帽管放正，轻磕管底使胶块落在管底。注意问题：每清洗一次胶块均重复如上操作。

5.3每一螺帽管中加入10ml预热的灭菌纯水，确保胶块在液面下而不在管壁或盖子上。将螺帽管放回水浴摇床中，振摇10分钟。

5.4时间到后，倒掉水，再用纯水洗一次。重复上述操作。

5.5倒掉水，加入已预热的TE液10ml，于50℃水浴摇床中振摇10分钟。

5.6倒掉TE液，再用TE液重复清洗三次，每次10分钟。

5.7倒掉最后一次的TE液，再加入10mlTE液，继续下一步酶切或4℃冰箱保存备用。

5.8注意问题：洗胶时一定确保胶块在液面下。

5. 酶切

6.1酶切缓冲液的配制：根据待检测的小胶块数量，按照操作规程，配制酶切缓冲液。例如，待检胶块5块，加上2个H9812标准,最少要配制8块的量，正好配制7块，最后一份吸的量会少，不准确，影响后面的分子分型图谱。

6.2取1.5ml无菌微量离心管，标记好。每管加入200ul配制好的酶切缓冲液。

6.3切胶块

6.3.1将裂解完的胶块连同TE液，倒入无菌的培养皿中，用小铲取出胶块放于干净的玻璃片上，用刀片切下2mm宽的胶块，放入含酶切缓冲液的微量离心管中。注意问题：一定确保胶块在液面以下。将剩余的胶块，放入TE液中，再倒入螺帽管中。

6.3.2标准菌株H9812的胶块同上述一样处理。

6.3.3切的胶块宽度不能太窄，也不能太宽，否则影响后期分子分型图谱。

6.4将放入胶块的微量离心管放在37℃水浴中孵育10分钟。注意问题：酶的种类不同酶切温度不同，按操作规程操作。

6.5配制酶切液：按操作规程配制酶切液。配制方法同酶切缓冲液的配制。不同点就是这里要加入酶，相应的灭菌纯水的量就少加些，配制的总量是不变的。

6.6用枪头吸出酶切缓冲液，吸的时候要仔细，不能损伤胶块。

6.7每一离心管加入200ul酶切液，注意问题：观察胶块是否在液面下面，一定确保胶块在液面以下。

6.8在水浴中孵育至少2小时，各实验室根据对某一菌株PFGE实验经验决定孵育时间。如果是某菌株第一次进行PFGE实验，则按照操作规程操作，记录孵育时间，积累实验经验。

7、电泳

7.1配制电泳液：首先配制0.5xTBE液2200ml。例如：购买的是5xTBE液，配制成0.5xTBE液2200ml，则加入5xTBE液220ml，再加入1980ml超纯水，混匀即可。

7.2配制电泳胶：根据待测菌株数量配制电泳胶的量。如果包括标准菌株是10株菌或10株以下则配制100ml 1% SeaKem Gold （SKG）电泳胶；如果是10株菌以上或15株以下则配制150ml 1% SeaKem Gold （SKG）电泳胶。注意问题： SeaKem Gold （SKG）电泳胶的浓度为1%，称量一定要准确，以免影响电泳后分子分型图谱。

7.3酶切完成后胶块的处理：

7.3.1从水浴中取出胶块，平衡到室温。

7.3.2用枪头吸出酶切液，要避免损伤或吸出胶块。

7.3.3 每一离心管加入 200µl 0.5×TBE液，室温平衡 5 分钟。

7.3.4调节胶槽水平，把梳子平放在胶槽上，把胶块加在梳子齿上。注意问题：标准菌株 H9812 加在第 1、5、10 位置的齿上（10 齿梳子）或第 1、5、10、15 位置的齿上（15 齿梳子）。

7.3.5用吸水纸的边缘吸去胶块附近多余的液体，在室温下风干约 5 分钟。

7.3.6把梳子卡入胶槽，确保所有的胶块在一条线上，并且胶块与胶槽的底面相接触。

7.3.7从胶槽的下部中央缓慢倒入熔化且在 56℃水浴摇床平衡的 1%SKG。注意问题：避免气泡的生成。如果有气泡，用枪头消除。在室温下凝固 30 分钟左右。

7.3.8记录梳子上加菌株的顺序。

7.4、电泳

7.4.1调节电泳槽水平，加入 2L 左右已配制的 0.5×TBE液，盖上电泳槽上盖。

7.4.2打开电泳仪主机和泵的开关，确保泵设在 70（这时缓冲液即0.5×TBE液的流速约 1L/分钟）且缓冲液在管道中正常循环。

7.4.3打开冷凝机，调节预设温度在 14℃（缓冲液达到该温度需要 20 分钟左右）。 注意问题：可以在7.3.8步骤结束后打开仪器，使冷凝机调节温度至14℃，以保障正常电泳。

7.4.4 30分钟胶块凝固后，打开胶槽的旋钮，取出凝固好的胶，用吸水纸清除胶四周和底面多余的胶，把胶小心放入电泳槽，加样孔方向朝上，盖上电泳槽盖子。注意问题：胶槽中取出胶块时一定要小心，胶块滑，易断折，要拿稳，否则整个实验就无法正常进行。

7.4.5设置电泳参数，不同菌的电泳参数不同，按照操作规程设置。记录电泳初始电流（通常 125ma左右）。

7.4.6注意问题:不同实验室，电泳时间可能不同。根据各自实验室的经验，调整电泳时间，使电泳胶中 H9812 最小片段距胶底端 1.0～1.5 厘米。

8染色：电泳结束后，取出胶，放在盛放 500ml Gelred 染料溶液的托盘内，摇床振幅每分钟50次，染色 30 分钟。

8.1注意问题：Gelred 溶液的配制1:10000稀释。例如：配制 500ml染色液，加Gelred 染液50ul，加超纯水500ml，加入NaCl3.0g,混匀。

8.2注意问题：胶块易断折，取胶块时要小心，两手轻轻托着，慢慢放入染色盒中。

9脱色：将染色后胶块放入盛有 500ml 超纯水的脱色盒中，脱色 30 分钟，如果成像背景有干扰，可以 30 分钟换一次超纯水，再脱色30-60分钟。注意问题：取胶块时要双手轻轻取出，再轻轻放入脱色盒中。

10、读胶成像

10.1打开成像仪开关，电脑相应软件，不同厂家成像仪操作不同。只要能够提供 IBM 兼容的未压缩的 TIFF 图像，且分辨力≥768 x 640 像素，能够用“国家致病菌识别网信息管理系统”对图谱进

行对比分析即可。

10.2成像时要调整好图像的大小，使图像占据整个窗口，胶的加样孔、下边界和左右边界在屏幕上都可以看到。

10.3保存图像，转为*.TIFF 格式。完成的图像要符合以下要求才能达到质量标准。

10.3.1凝胶应该占据整个 TIFF 图像 ，TIFF 图像应该包括加样孔 ，H9812 最小的片段应该距胶的下沿1-1.5cm。

10.3.2泳道笔直，各个泳道的条带亮度均匀一致，整个泳道的所有条带清晰，易识别。

10.3.4酶切完全，没有DNA的降解现象，凝胶背景干净。

整个PFGE实验步骤繁杂，完成一次实验至少需要4天。一定按操作规程认真操作，其中任何一步完成的不好都会影响最后的成像。操作者一定要认真学习操作规程，熟悉流程，关注每步中的注意问题，使实验结果符合质量标准。实现 PulseNet China 网络实验室监测技术能力标准化和规范化。