边境口岸进口马的传染性贫血检疫及防控建议

边境口岸进口马的传染性贫血检疫及防控建议

古丽努尔 ·阿吾里别克

新疆吉木乃喀尔交镇农牧业（林业）发展服务中心

作者姓名：古丽努尔·阿吾里别克

性别：女

出生年月：1978年8月15日

祖籍：新疆吉木乃县

学历：大学本科

研究方向：动物疫病检测与防疫工作

职称：高级兽医师

摘要： 马传染性贫血可人畜互传，一旦发生很难消灭。本文分析了马传染性贫血的临床诊断，以及病毒分离鉴定、酶联免疫吸附试验和琼脂凝胶免疫扩散试验几种检测方法。实际管理中应积极采取养、防、检、消、隔、处等综合性防治措施，为马匹创造安全的生长环境。

关键字：马传染性贫血，检疫，防控

1. 引言

马传染性贫血病(EIA)是由反录病毒科慢病毒亚科中的马传染性贫血病病毒引起的马、骡、驴传染病，属于二类传染病、寄生虫病。我国在1955年证实有此病，仅能感染马属动物（马、骡、驴）。在自然条件下，以马的易感性最高，骡、驴次之，并且该病没有品种、性别或年龄的差异，没有严格的季节性和地区性。传染途径主要通过蚊、蝇、蜢等吸血类昆虫的叮咬，或者通过被病毒污染的器械等，因此在吸血虫较多的夏秋季节以及森林、沼泽地带发病较多。

2. 马的传染性贫血临床诊断

马的传染性贫血特征主要表现为间歇性发烧（持续高热3-5天，然后3-15天常温间歇期又复发）、高热（39℃以上）、消瘦、进行性衰弱、贫血、出血和浮肿；在无烧期间则症状逐渐减轻或暂时消失，有的出现温差倒转现象。患病马在口腔、舌底、鼻腔、眼结膜、阴道粘膜等处常见鲜红色至暗红色出血点。在流行初期多呈急性型经过，具有很高的致死率，以后呈亚急性或慢性经过。该病具有20-40天的潜伏期，最长的可以达到90天。

3. 马的传染性贫血实验室检测方法

3.1病毒分离鉴定

按照要求制备细胞培养液（80mL）、赛氏液、细胞生长液、阿氏液、驴外周血白细胞等。对被检马属动物采用无菌方式采集抗凝血，在室温下放置30-40分钟，收集中间淡黄色的白细胞层，分装到管中后使用4000r/min的离心机离心10分钟后弃上清液，白细胞沉淀后保存到-80℃冰箱。在驴外周血白细胞中加入细胞生长液后培养1-2天，如果细胞已经贴壁并伸出突起，就可以接种病料了。去掉培养液，接种500L病料，37℃吸附1-2小时后吸弃接种的病料，更换新鲜的细胞生长液。

接种病料在5%二氧化碳培养箱内恒温37℃培养7-8天，通常情况下初代分离培养不会出现细胞病变，盲传2-3代后可能出现。每天在倒置显微镜下观察，如果盲传2-3代后没有出现细胞病变，则可以判定为阴性；如果出现细胞变圆、破碎、脱落等的细胞病变，初步判定为阳性。确诊还需要进行酶联免疫吸附试验和琼脂凝胶免疫扩散试验。

3.2酶联免疫吸附试验

以1：100浓缩的阳性培养物为抗原进行酶联免疫吸附试验，按照常规方法静脉采集马属动物血液并分离血清，在2℃-8℃条件下冷藏保存。制备病毒培养液，以原体积1:100浓缩阳性培养物，并以浓缩阳性培养物为包被抗原，包被聚苯乙烯微量板孔，使免疫反应在固相载体上进行。如果被检血清中有马传染性贫血病毒抗体存在，则与孔壁上的抗原形成抗原-抗体复合物，再与酶标记的抗体反应，最后通过测定酶作用底物催化后的产物，进行定性、定量抗体测定。

试验结果判定可以使用目测法或比色法。使用目测法时，阳性对照血清孔呈现鲜明的橘黄色，阴性对照血清孔则无色或基本无色，因此被检血清孔呈显色者就是马传染性贫血病毒抗体阳性，如果颜色反应较弱，但与阴性对照血清孔还有差异，这时可以使用比色法测定最终结果。比色法使用酶标测试仪，在波长492nm下测定各孔OD值，阳性对照血清的两孔平均OD值大于1.0，阴性对照血清两孔平均OD值小于等于0.2为正常反应。如果被检血清的两孔平均OD值与阴性对照血清的两孔平均OD值之比大于等于2，且被检血清的两孔平均OD值在0.2以上者，判定为马传染性贫血病毒抗体阳性，否则为阴性。

3.3琼脂凝胶免疫扩散试验

准备器材微量移液器、平皿、三角瓶、薄壁性金属打孔器等，配制PBS溶液，将标准抗原、标准阳性血清、阴性血清按照规定稀释到工作浓度。制备血清、病原和琼脂板。制备琼脂板时，使用优质琼脂1g，直接放入含有万分之一硫柳汞的100mL的PBS液中，用热水浴融化混匀，倒入平皿中15-18mL，冷却备用。然后在琼脂板上打孔，在坐标纸上画好七孔型图案，放在带有琼脂板的平皿下面，按照图案中孔的位置使用金属管打孔，取出切下的琼脂板，注意不要使平皿底面和琼脂膜离动，打孔完成后再琼脂板上标明日期和编号。孔径尺寸为：外周孔径5mm，中间孔径5mm，孔间距3mm。

滴加样品进行检测，在七孔型的中央孔加抗原，对角两孔加标准阳性血清，其余加入受检血清，进行血清抗体检测；在七孔型的中央孔加阳性，对角两孔加标准阳性抗原，其余孔加入受检病毒分离物，进行病毒分离物鉴定。滴加样品后，平皿加盖，等孔中液体被吸干后，倒置平皿以保持一定水分。将琼脂板放到铺有数层湿纱布的带盖搪瓷盘中，在15℃-30℃条件下进行温育，每天观察并记录结果，连续3天。

血清抗体检测，阳性判定标准为：当标准阳性血清孔与标准阳性抗原孔之间只有一条明显致密的沉淀线时，受检血清孔与标准阳性抗原孔之间形成一条沉淀线，或者阳性血清的沉淀线末端向毗邻的受检血清的抗原侧偏弯者，则判定为阳性。阴性判定标准：受检血清与标准阳性抗原孔之间不形成沉淀线，或者标准阳性血清孔与标准阳性抗原孔之间的沉淀线向毗邻的受检血清孔直伸或向受检血清孔侧偏弯者，则判定为阴性。疑似判定：标准阳性血清孔与标准阳性抗原孔间的沉淀线末端，似乎向毗邻受检血清孔内侧偏弯，如果不易判断，可将标准阳性抗原稀释2、4、6、8倍后进行复试，然后再判定结果，相应的可以延长观察时间。

病毒分离物判定标准，阳性：当标准阳性血清孔与标准阳性抗原孔之间只有一条明显致密的沉淀线时，病毒分离物孔与标准阳性血清孔之间形成一条沉淀线，或者阳性抗原的沉淀线末端向毗邻的病毒分离物的抗原侧偏弯者，则判定为阳性。阴性判定标准：病毒分离物孔与标准阳性血清孔之间不形成沉淀线，或者标准阳性抗原孔与标准阳性血清孔之间的沉淀线向毗邻的病毒分离物直伸或向病毒分离物侧偏弯者，则判定为阴性。疑似判定：标准阳性血清孔与标准阳性抗原孔间的沉淀线末端，似乎向毗邻病毒分离物孔内侧偏弯，如果不易判断，可将标准阳性血清稀释2、4、6、8倍后进行复试，然后再判定结果，相应的可以延长观察时间。

3.4综合判定

在对马传染性贫血做出初步判断后，再进行实验室诊断进行确诊。根据病毒分离的鉴定结果做出病原学确诊。根据酶联免疫吸附试验结果可初步判定为血清学阳性，根据琼脂凝胶免疫扩散试验结果可以最终判定为血清学阳性或阴性。

4. 马的传染性贫血防控措施

4.1加强检疫

对于异地调入的马匹必须来自非疫区，调入后必须隔离观察30天以上，经过地方动物检疫部门临场综合诊断和血清学检查后，确认不携带传染性贫血病毒，才可以放入马群饲养。

调出马的部门要按规定进行报检，经过当地防疫监督部门血清学等检疫，确认没有问题后才可以调出。马属动物凭当地动物防疫部门出具的检疫证明运输，如果运输途中发现疑似马传染性贫血症状，应立即联系就近的动物防疫监督部门进行隔离检查和现场诊断，包括流行病学调查、病理解剖检查、实验室诊断等，采取必要的防治措施，确诊后由动物防疫部门就地监督实施捕杀等处理。

4.2做好监测和净化

在马传染性贫血控制区，采取监测、捕杀、消毒、净化的综合防治方法，如果检出阳性马属动物，应按规定捕杀处理，并对其所属的马群进行临床和血清学检查，每隔3个月检查一次，直到连续两次血清学检查均为阴性为止。对该病控制区域内的6-12月龄幼驹，每年要使用血清学方法监测一次。

在没有马传染性贫血的地区，采取监测为主的防治措施，每年抽取1%区域内的马属动物，抽取数量不少于100匹，进行血清学检测，出现问题及时防治。

5. 总结

本文分析了马传染性贫血的临床诊断，以及病毒分离鉴定、酶联免疫吸附试验和琼脂凝胶免疫扩散试验几种检测方法。马传染性贫血可人畜互传，一旦发生很难消灭，因此应积极采取养、防、检、消、隔、处等综合性防治措施，加强饲养管理，为马匹创造安全的生长环境。

参考文献

[1]范小蕊，马传染性贫血及其防治[J]，养殖技术顾问，2012,7

[2]熊丽文，严斯刚，韦杏香，马传染性贫血综合防治措施[J]，养殖与饲料，2010,4