海口奇力制药股份有限公司 570000
摘 要
目的:建立阿莫西林颗粒溶出曲线(介质:醋酸盐缓冲液pH4.0)测定方法,并进行方法学验证,用于一致性评价样品醋酸盐缓冲液pH4.0溶出曲线测定;方法:以十八烷基硅烷皱键合硅胶为填充剂,流动相为0.05mol/L磷酸二氢钾溶液(用2mol/L氢氧化钾溶液调节pH值至5.0)-乙腈(97.5:2.5),检测波长254nm,流速1.0ml/min,进样量:50µl。结果:本法在27.9µg/ml~279.2µg/ml浓度范围内线性良好,相关系数R2值达0.9999;精密度试验阿莫西林主成分保留时间和峰面积保留时间RSD值均小于1.0%;准确度试验平均回收率100.3%;专属性试验阿莫西林主峰保留时间处无辅料及溶剂峰;溶液稳定性试验表明本品溶液在24h内稳定。结论:本方法具有专属性强、精密度、准确度高,溶液稳定性好的特点,且操作简单迅速,适用于阿莫西林颗粒醋酸盐缓冲液pH4.0介质溶出曲线测定。
关键词:阿莫西林颗粒;溶出曲线;高效液相色谱法;方法学验证;
阿莫西林颗粒为抗感染药品,用于敏感菌所致的溶血链球菌、肺炎链球菌、葡萄球菌或流感嗜血杆菌所致中耳炎、鼻窦炎、咽炎、扁桃体炎等上呼吸道感染等的治疗【1】。海口奇力制药于2003年1月29日彷制获批,批准文号为国药准字H46020584。按国家食品药品监督管理总局口服制剂一致性评价相关要求(2015)【2】,本品需开展与原研或参比制剂一致性评价相关工作,根据普通口服制剂参比制剂选择与确定指导原则【3】确定本品参比制剂为日本LTL制药株式会社生产的阿莫西林细粒剂(规格为100mg︰1g),本文探讨口服制剂一致性评价关键指标之一醋酸盐缓冲液pH4.0介质溶出曲线检测方法的建立及验证,评价该方法的适用性。
一、材料与试剂
1.1、仪器
岛津LC-2030CHT高效液相色谱仪(配备紫外检测器);奥豪斯EX125DZH型十万分之一电子天平;上海康仪PHS-3酸度计。
1.2、试剂
乙腈(色谱纯) 规格:4L 来源:TEDIA;
磷酸二氢钾(分析纯) 规格:500g 来源:广州化学试剂厂;
氢氧化钾(分析纯)规格:500g 来源:广州化学试剂厂;
1.3、供试品
彷制制剂:阿莫西林颗粒,批号为2005001、2005002、2005003,均为海口奇力制药股份有限公司生产。
参比制剂:阿莫西林细粒 批号为2008A02,日本LTL制药株式会社生产。
1.4、对照品
阿莫西林工作对照品,根据中检院对照品自行标定,批号为20201014,含量:87.2%。
二、实验方法
2.1、色谱条件
采用COSMOSIL 5C18-PAQ (4.6×150mm,5µm)色谱柱;流动相为0.05mol/L磷酸二氢钾溶液(用2mol/L氢氧化钾溶液调节pH值至5.0)-乙腈(97.5:2.5),柱温:室温,检测波长254nm,流速1.0ml/min,进样量:50µl。
2.2、溶液配制
系统适用性溶液:同对照品溶液。
对照品溶液的制备:取阿莫西林对照品适量,精密称定,用溶出介质定量稀释制成0.14mg/ml的溶液。
供试品溶液的制备:取本品1袋(规格0.125g),照溶出度与释放度测定法(中国药典2020年版四部通则0931第二法),以醋酸盐缓冲液pH4.0 900ml为溶出介质,转速为每分钟50转,依法操作,经5、10、15、30、60分钟时,取溶液10ml(同时补加相同温度相同体积的溶出介质),滤过(至少弃去初滤液3ml),取续滤液即得。
溶出介质(醋酸盐缓冲液pH4.0)的配制:取醋酸钠1.22g,加入2mol/L醋酸溶液【取120.0g(114mL)冰醋酸用水稀释至1000mL,即得】20.5ml,加水溶解并稀释至1000mL,摇匀,即得
2.3、测定法
照《中国药典》2020年版四部通则高效液相色谱法【4】,精密量取系统适用性溶液50µl注入高效液相色谱仪,重复进样5次,峰面积RSD应小于2.0%,再分别精密量取对照品溶液、各取样点供试品溶液50µl,依次注入高效液相色谱仪,等度洗脱,记录色谱图,按外标法以峰面积计算供试品中阿莫西林溶出量。
三、实验结果
3.1、方法的建立
本法引用自中国药典2020年版二部阿莫西林原料含量测定方法,由于阿莫西林颗粒加入了蔗糖、糊精、香兰素等辅料,需要进行方法学验证,检查方法的适用性。
3.2、方法学验证结果
3.2.1、线性与范围
取阿莫西林对照品适量,精密称定,加溶出介质定量稀释制成含阿莫西林浓度分别为27.9µg/ml、83.8µg/ml、111.7µg/ml、139.6µg/ml、195.4µg/ml、279.2µg/ml、的系列对照品溶液,按照以上确定的色谱条件,分别进样50µl,峰面积分别为246777、733379、961312、1205738、1667003、2373317,以阿莫西林的浓度(µg/ml)为横坐标,峰面积为纵坐标,将峰面积与对应浓度值做直线回归,求得直线回归方程为y=8442.9x+19380,其相关系数R
2=0.9999。结果表明,阿莫西林浓度在27.9~279.2µg/ml范围内线性关系良好。线性关系图见下图1。
图1标准曲线图
3.2.2、精密度试验
取“3.2.1线性与范围”项下“线性供试品溶液(1)、(4)、(6)”分别作为20%、100%、200%精密度试验溶液,精密量取上述溶液各50µl,分别注入液相色谱仪,记录色谱图。各溶液均连续进样6次,计算主成分保留时间和峰面积的RSD值。阿莫西林保留时间RSD值均小于0.2%,峰面积RSD值均小于0.2%,说明本法精密度良好。试验结果见下表1
表1 精密度试验
名称 次数 | 20%浓度 | 100%浓度 | 200%浓度 | |||
RT(min) | A | RT(min) | A | RT(min) | A | |
1 | 4.804 | 246735 | 4.831 | 1203454 | 4.852 | 2367627 |
2 | 4.805 | 246561 | 4.833 | 1203312 | 4.853 | 2367539 |
3 | 4.806 | 246566 | 4.833 | 1204372 | 4.856 | 2366654 |
4 | 4.810 | 246544 | 4.834 | 1204209 | 4.859 | 2366107 |
5 | 4.814 | 246208 | 4.834 | 1204662 | 4.862 | 2365512 |
6 | 4.817 | 246305 | 4.834 | 1203188 | 4.865 | 2364815 |
均值 | 4.80933 | 246486.500 | 4.83317 | 1203866.167 | 4.85783 | 2366375.667 |
RSD(%) | 0.1% | 0.1% | 0.02% | 0.05% | 0.1% | 0.05% |
3.2.3、准确度试验
对照品溶液:取阿莫西林对照品约16mg,精密称定,置100ml量瓶中,加水适量,超声使溶解,并用溶出介质稀释至刻度,摇匀,即得。
空白辅料溶液:称取蔗糖54.5g,糊精0.625g,枸椽酸钠31.25mg,日落黄铝色淀30mg,香兰素6.25mg,草莓味香精62.5mg,桔子味香精62.5mg,置250ml量瓶中,加水溶解并稀释至刻度,摇匀,精密量取5ml,置10 ml量瓶中,加溶出介质稀释至刻度,摇匀,即得。
供试品溶液(70%浓度):取阿莫西林对照品约11.2mg,精密称定,置100ml量瓶中,同时加入处方量的空白辅料溶液1ml,加溶出介质适量,超声使溶解并用溶出介质稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得70%浓度回收率供试品溶液。平行配制3份。
供试品溶液(100%浓度):取阿莫西林对照品约16mg,精密称定,置100ml量瓶中,同时加入处方量的空白辅料溶液1ml,加溶出介质适量,超声使溶解并用溶出介质稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得100%浓度回收率供试品溶液。平行配制3份。
供试品溶液(120%浓度):取阿莫西林对照品约19.2mg,精密称定,置100ml量瓶中,同时加入处方量的空白辅料溶液1ml,加溶出介质适量,超声使溶解并用溶出介质稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得120%浓度回收率供试品溶液。平行配制3份。
精密量取上述溶液各50µl,分别注入液相色谱仪,记录色谱图,按外标法以峰面积计算。
试验结果表明:各浓度下平均回收率均在98.0%~102.0%之间,9份样品回收率RSD值均小于2.0%,符合验证要求,说明本法准确度良好,具体结果见下表2。
表2 回收率试验结果
浓度 | 投入量(mg) | 测得量(mg) | 回收率(%) | 平均回收率(%) | 平均回收率(%) | RSD (%) |
70% | 10.08 | 10.22 | 101.4 | 101.0 | 100.3 | 0.67 |
10.13 | 10.18 | 100.5 | ||||
10.32 | 10.46 | 101.3 | ||||
100% | 14.34 | 14.36 | 100.1 | 100.1 | ||
14.41 | 14.48 | 100.5 | ||||
14.52 | 14.46 | 99.6 | ||||
120% | 16.64 | 16.61 | 99.8 | 99.8 | ||
16.77 | 16.75 | 99.9 | ||||
17.03 | 16.97 | 99.7 |
3.2.4、专属性试验
按本品制剂处方配制无阿莫西林的空白辅料溶液及空白溶剂(pH4.0醋酸盐缓冲液),依法测定,与供试品溶液图谱比较。试验结果表明供试品阿莫西林保留时间约为4.8min,而空白辅料溶液在主峰附近数分钟范围内均无吸收峰,说明阿莫西林颗粒辅料中不含有干扰主成分检测的物质,方法专属性良好。
图2供试品溶液图谱
图3空白辅料图谱
图4空白溶剂图谱
3.2.5、溶液稳定性试验
供试品溶液:取阿莫西林颗粒约144mg,精密称定,置100ml量瓶中,加pH4.0醋酸盐缓冲液适量,超声处理5min,用pH4.0醋酸盐缓冲液稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
将上述供试品溶液于低温(4℃)下放置24小时,分别于放置的第0h、2h、4h、6h、8h、12h、18h、24h时,精密量取50µl,分别注入液相色谱仪,记录色谱图。
试验结果表明:在pH4.0醋酸盐缓冲液介质中,供试品溶液低温(4℃)下放置24h,峰面积RSD值<2.0%,溶液稳定,具体结果详见下表3。
表3 溶液稳定性试验结果
时间(h) | 主峰面积 |
0 | 1234741 |
2 | 1232482 |
4 | 1230831 |
6 | 1228565 |
8 | 1225767 |
12 | 1224053 |
18 | 1218735 |
24 | 1215320 |
均值 | 1226311.8 |
RSD(%) | 0.55 |
3.3、阿莫西林颗粒样品溶出曲线(介质:醋酸盐缓冲液pH4.0)测定结果
按本法检测2005001、2005002、2005003批阿莫西林颗粒样品溶出曲线(介质:醋酸盐缓冲液pH4.0),并与参比制剂结果进行比较,溶出曲线相似因子f2值分别为51、52、51,均大于50,符合溶出曲线相似性要求。
四、结论
中国药典2020年版二部阿莫西林颗粒制剂质量标准中无溶出度及溶出曲线项目,因一致性评价工作需要,采用药典收载的阿莫西林原料含量测方法,变更进样量为50µl,该方法操作简便、用时短、结果准确,各项方法学验证结果良好,适用于阿莫西林颗粒溶出曲线(介质:醋酸盐缓冲液pH4.0)的测定。
参考文献
[1] www.baidu.com百度百科 阿莫西林
[2] 国家食品药品监督管理总局口服制剂一致性评价要求 2015
[3] 普通口服固体制剂参比制剂选择和确定指导原则2016-03-18
[4] 国家药典委员会 中国药典2020年版四部 通则0512高效液相色谱法P59