细菌总数是怎么检验的

细菌总数是怎么检验的

曾祥华

万源市疾控预防控制中心 四川达州 636350

我们在疾病预防控制工作中每年都会对辖区内食物中毒所引发的事件进行统计和梳理，发现食物中毒的比例逐年提升，并且还有些严重情况是由于食物中毒而导致的死亡。在这些引人深思的食物中毒事件当中，由于细菌食品中毒的事件占到了1/4左右，而最重要的致病原因就是微生物致病菌的存在。在临床检验时对于细菌总数的检验也是重要的参照指标，本篇文章关于细菌总数检验过程进行论述和探讨，希望更多的人能够对于这一检验过程有一定的了解，加深对于临床检验知识的认知。

1显微镜直接计数法进行细菌总数检验

1.1直接涂片计数法

直接图片计数法的操作方法是需要经过适当稀释之后的样品均匀涂布在载玻片的一平方厘米方格内，然后进行一系列的后续操作，譬如样品干燥、固定及革兰氏染色，最后用显微镜来观察计数。接下来逐步讲解每一步的具体操作，在进行涂片操作时，首先接触到的工具是接种环，用接种环挑取单菌落，然后滴入生理盐水，并保证涂布的均匀性，借助于火焰的光热完成热固定操作。涂布完成之后需要进行的是初染操作，需要将结晶紫滴入一滴左右，然后静置一分钟，起到染色目的，一分钟之后进行水洗，将多余的结晶紫染料冲洗掉。初染结束之后需要进行媒染，媒染过程中所使用的是碘液，同样加入一滴的碘液，在滴入之后静止一分钟，然后再借助水洗操作，将多余的碘液冲洗掉，这两步结束之后需要进行的是脱色处理。脱色所使用到的是95%的乙醇，将95%的乙醇滴入30秒后进行复染。复染所使用的是复红，复红滴入持续时间也约为30秒，然后才可进行下一个阶段。在借用显微镜进行细菌观察之前，先要用物镜测量出油镜视野的直径，然后再依次计算10~15个视野内的细菌总数，计算出其平均值。直接图片计数法，拥有操作简单快捷的特点。但是这一技术方法无法准确区分出视野内的活菌与死菌，一般来说会将死菌也计算在细菌总数当中，导致最终的计数结果偏高，所以只将这种方法应用于菌数较高的样本或者是单细胞微生物。

1.2血球计数板计数法

在计数之前需要进行样品的适当比例稀释，然后将其注入血球板的计数室当中，因为已知的计数室容积是0.1立方毫米，所以计算这一微小体积内的菌落总数，就可以推算出每克样品或者是每毫升样品的总菌落数。其计算公式可为细菌体细胞数等于每一小格内平均菌体细胞数乘以400×104x稀释倍数。血球计数板计数法具有操作简便的技术特点，基本上可以在10分钟左右就获取细菌总数的计算结果，但是由于待测样本没有在计数过程中经过火焰来杀死固定细胞，所以检测结果一般为活菌数目，这个方法适用于计数单细胞的酵母菌。

2平皿菌落总数测定法

平皿菌落总数测定法也是临床非常常见的一种针对于活菌的计数方法，也是我国卫生标准规定当中公认的一种可行计数方法，所以也将这项方法称之为标准平皿活菌计数法。应用这种检测方法来检测菌落总数，一般是要将样品经过处理之后在培养基当中进行合适温度及合适条件的培养，然后即能够得到每克样品当中所形成的微生物菌落总数。这一技术方法所得出的结果只包括在平板计数琼脂当中生长发育的温室当中需要氧气或者是兼性厌氧细菌的菌落总数需要注意区分一个概念，那就是菌落总数并不等同于细菌总数。平板菌落计数法的整体操作流程是需要先选择好即将检测的样品，然后用生理盐水在无菌的操作条件下进行样本的稀释，将样本借助于不同的稀释操作制成几个恰当稀释倍数的悬液，然后随机选择其中的2~3个恰当的稀释梯度悬液各一毫升，将其加入无菌的空培养皿当中，每一个被选择的梯度悬液需要针对性加入到2~3个培养皿当中，融化并冷却之后，在37摄氏度的环境当中培养48个小时，然后观察计算这48个小时内出现的菌落，得出最终的结果。

3最近似数值测定法

最近似数值测定法首先需要对于拿到的样本进行连续性的梯度稀释，一般为10倍稀释操作，然后选择三个连续的10倍稀释液。将这三个连续的10倍稀释液接种到三管原本就装有培养基的试管当中进行后续培养，然后根据此培养实验结果来检索 MPN检索表，从而得知样品当中微生物的具体数量。 MPA所具有的显著特点就是操作极其方便，相对来说相似率要比SPC更高一些，并且在检测过程中还可以选用具有选择性的培养基应用于特殊的微生物菌群，尤其适合于样本当中含金量比较少的样品，当然这种方法也是存在一定检测缺点的，那就是在整个检测环节需要使用到大量的玻璃性器皿，并且不能够在培养过程中对于微生物的菌落生长形态进行实时观察，整个操作过程比较严格规范，需要保证整个操作在无菌的条件下进行。这样的操作要求还是比较高的，对于缺乏无菌操作室的医院来说很难达到这样的严格操作标准。

4还原实验法

还原实验法也是一种对于活性微生物数量进行粗略估计的计算方法，这一计算方法的原理即是在微生物细胞进入生物代谢的氧化还原反应过程中进行样品内菌数的判定，有一部分微生物细胞在进入这一还原反应的过程中会被氧化，而有些会被还原，测定其还原能力就可以大略推测出样品内的菌数。而其还原能力主要是依靠于某些指示剂和色素进行侧面反映的，这些成分的还原时间一般与细菌数量成反比。掌握这两者之间的相互关系，即可以很好的粗略估算出样品当中活性微生物的数量。还原实验法能够在较短的时间内得出可靠的计算结论，但也在某些情况下会有结果不够准确的表现，不能将其应用于还有还原性酶的检验样品当中。

总而言之，针对细菌总数的检验在社会生活的方方面面都能够给我们带来极大的帮助和科学研究上的参考，对于人们疾病的检测和生活品质的提升都能够产生非常重要的影响。人们生活水平在不断提高的过程中，对于临床检测技术的要求也在不断提升，越来越要求临床检测技术的规范化和高水平化，只有不断加大对于各项检测技术的研究和了解，并使检测流程规范严格起来，才能够保证临床检测所得出的最终结果是具备参考价值的。希望我们在今后的临床检验项目能够更具有科学性和规范性，检测细节之处也应该要逐渐变得严苛起来，良好的把握检测细节才能够确保最终的检测结果。相信通过本篇文章，人们能够对于临床细菌总数的检验过程有一定的了解，针对不同的样本，医师和检测人员会选择不同的细菌总数检验方法，以确保最终所得的结果是具备临床参考价值的，也还应多多拓展新的临床检测方法，不断缩减检测耗时，使我们临床检验工作进一步提高。