高效液相色谱串联质谱在药物分析中的应用

高效液相色谱串联质谱在药物分析中的应用

方杰明

南昌大学 江西 南昌 330036

摘要：高效液相色谱是利用物质的理化特性，让其在固定相和流动相之间相互作用，从而达到分离和分析的目的，具有简便、灵敏、快速、重复性好、准确等特点，被广泛应用在各个领域。本文综述了高效液相色谱串联质谱在药物有关物质分析中的应用和重要作用。

关键词：高效液相色谱；高效液相色谱串联质谱；药物分析

1. 引言

俄国植物学家茨维特早在1906年研究叶绿素的分离时发现了色谱法，时至今日，色谱法有了巨大的进步，比如常用的有气相色谱法（GC）、高效液相色谱法（HPLC），高效液相色谱又可以分为正相和反相液相色谱、离子交换液相色谱、体积排阻液相色谱等等。高效液相色谱具有操作简便、分析速度快、重复性好等优点，常用的检测器有紫外检测器（UV）、二极管阵列检测器（DAD）、荧光检测器（FLD）、质谱检测器（MS）、飞行时间质谱检测器（Q-TOF）等，其中质谱检测器和和飞行时间质谱检测器具有高灵敏度、高分辨率的特点。

在制药领域中，高效液相色谱法得到了广泛的应用^[1]。在化学药品的分析中，由于成分含量低，检测较困难，高效液相色谱则很好的解决了这个问题；在中药的分析中，由于其成分复杂，含量不高，且相似物多，给分析检测带来了一定难度，运用高效液相色谱法则突破了这个限制；在生物制药中，高效液相色谱法，尤其是液质联用技术对药物的分析、质量控制等方面发挥着重要的作用，如用Qda质谱检测器（Waters公司）检测单抗中N糖^[2],对单克隆抗体质控方法的建立^[3]等。此外高效液相色谱法对于在职业病的发现方面也提供了很好的助力^[4]。

2. 高效液相色谱串联质谱的特点和在药物分析中的应用

早在1921年就诞生了第一台质谱仪，到现在有了将近百年的发展，在质谱技术发展初期，主要是对物质中的同位素进行测定，随着色谱质谱联用技术的不断发展，其应用领域不断扩大，在生物学、医药等领域都有着很好的应用，成为了必不可少的分析技术手段之一。高效液相色谱仪与质谱仪之间由离子源进行了连接，现在使用最为普遍的是大气压电离，分为大气压电喷雾电离（ESI）和大气压化学电离（APCI）两种电离模式的离子源，大气压电喷雾电离（ESI）适用于极性强、分子量大的有机物质，易形成多电荷离子，故可测大分子；大气压化学电离（APCI）适用于极性弱、分子量较小的物质，主要产生单电荷离子，限于质量检测器质量分析范围，一般测试分析分子量在1000以下的有机物质。

高效液相色谱串联质谱技术把高效液相色谱的高分离特点和质谱的高分辨率特点相结合，形成了具有高分离度、高分辨能力、应用范围广和专属性强等特点的分离分析技术。在制药领域，高效液相色谱串联质谱技术发挥了非常重要的作用，在药物的原料药、中间体、生产和储存过程中都可能产生杂质，同时在药物的降解过程中（如：热不稳定、光照、氧化等作用下）也会产生杂质。根据ICH指导原则，杂质含量≥0.1%或1.0mg的情况，需要鉴别杂质的物质结构；在2020版《中国药典》中也规定到：新药研制部门对在合成、纯化和贮存中实际存在的杂质和潜在的杂质，应采用有效的分离分析方法进行检测。对于表观含量在0.1%及其以上的杂质以及表观含量在0.1%以下的具强烈生物作用的杂质或毒性杂质，予以定性或确证其结构。对在稳定性试验中出现的降解产物，也应按上述要求进行研究。新药质量标准中的杂质检查项目应包括经研究和稳定性考察检出的，并在批量生产中出现的杂质和降解产物，并包括相应的限度，结构已知和未知的这类杂质属于特定杂质。在美国药典的正文中规定：列为特定杂质的杂质，其控制限度不高于美国药典的限度。此外，根据FDA指南中的“药物中的杂质”，杂质的含量小于0.1%时，一般不必进行鉴定，然而，对于那些可能有异常作用的、杂质浓度小于0.1%也可以产生毒性或药理作用的潜在杂质也应当进行鉴定。药物中的杂质大多数具有潜在的生物活性，有的与药品相互作用，能影响药物安全性及效能，甚至产生毒性作用。通过高效液相色谱的高分离特点，可以把药物中的杂质进行分离分析，特别是一些微量杂质，再通过质谱仪把分离出来的物质进行单级或多级的碎片化处理，获得相对应的碎片化离子信息，就可以鉴别、推导出杂质的结构，获得物质信息，对药物的安全使用提供了很好的依据，在药物的纯化和工艺改进过程中起到了至关重要的作用。刘永福^[5]基于高效液相色谱串联质谱，建立了一种简单有效的血浆多肽提取方法，通过液质联用技术的多反应监测法成功实现了目标多肽和蛋白质定量测定，优化了血浆内源性多肽提取方法，该方法可以推广到复杂样品中的多肽和蛋白质的定量分析。

3. 高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱联用仪的特点和在药物分析中的应用

高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱（HPLC-Q/TOF）是液质联用技术中很有代表性的技术之一，是由四级杆（Q）和飞行时间质谱（TOF）串联组成的质谱，飞行时间质谱分析系统的工作原理是离子受到加速电压的作用离开离子源后，在一个无场趋于内飞行直至抵达检测器，各种质荷比的离子接受相同动能，由于它们的质量各不相同，因而速度有差异，较轻的离子具有较高的速度，而较重的离子速度较慢，所以达到检测器的时间也就不尽相同，达到了高分辨的效果。四级杆-飞行时间质谱仪主要是由离子源、四级杆、碰撞池、检测器、飞行管等部件组成，目前常用的离子源为大气压电喷雾离子源（ESI）。HPLC-Q/TOF不仅有高效液相色谱的高分离度，还有四级杆的高选择性和飞行时间质谱的高分辨率的特点，能准确的检测到物质的精确分子量，且检测的分子量范围大、扫描速度快等，由于能提供精确质量数，所以可建立精确质量数据库，包括化合物的名称、分子式、精确分子量及保留时间等信息，通过检测得到的精确分子质量数与数据库进行匹配，可以获得化合物的化学式，使化合物的鉴定更加准确；即使在没有对照品的情况下，也能通过数据库检索快速准确地进行定性检测。

基于HPLC-Q/TOF技术的特点和其优越性，已被广泛应用于医学中的临床医学、医药、生物制药中多肽和糖类的检测等众多领域中。杨帆^[6]运用液质联用技术分析了成年SD大鼠血液-脑脊液屏障( 即脉络丛组织)中的多肽组，共鉴定到163个多肽(P<0.001)，为SD大鼠脉络丛组织的生理功能研究及组织多肽组学的研究方法提供了有价值的科学资料。

3.讨论与展望

目前市场上占有率比较高的仪器主要包括安捷伦（Agilent）、赛默飞世尔（Thermo Fisher Scientific）、沃特世（Waters）等供应商。而且随着近些年来科技的高速发展，尤其是设备智能化的快速发展，仪器的软件升级越来越往简便化、智能化的方向发展，同时设备的硬件也越来越精密，使得仪器性能不断的提高，以满足越来越复杂的分离分析需求。因其分离速度快、进样量小、样品前处理简单、分离度高、溶剂消耗少、分辨率高等优势，成为了药物的分析工作中必不可少的技术手段之一，为药物的纯化、工艺改进、杂质的发现和鉴定提供了重要的数据支撑，在药物质量控制体系建立的过程中发挥了非常重要的作用。

参考文献

[1]雷胜勇，宋丽明，蒋庆峰，液质联用技术在药物的有关物质分析中的应用，现代仪器，2011,17(4):9-13.

[2]王文波，于传飞，张峰，超高效液相色谱串联Ｑｄａ质谱法检测单抗Ｎ糖的研究，中国药学杂质，2018,53(3):223-227.

[3]张峰，于传飞，王文波，人源化抗血管内皮生长因子单克隆抗体质控方法的建立，中国药学杂质，2016,51(13):1101-1106.

[4]刘婕，梅勇，王娅男，高效液相色谱法测定尿中甲基马尿酸的规范化研究，中国卫生检验杂志，2013,23(3)：547-550.

[5]刘永福，贾小芳，腾珍林等，液质联用多反应监测法定量目标多肽或蛋白质，中国生物化学与分子生物学报，2012，28(1):86-92.

[6]杨帆，敬海明，张拓等，MALDI-TOF/TOF和LC-MS/MS液质联用分析大鼠脑脉络丛的多肽组，中国生物化学与分子生物学报，2010，26(7):659-671.

作者简介：

方杰明（1988—），男，汉族，浙江省衢州市，研究生，单位：南昌大学，研究方向：生物制药技术