生物制药工程中无细胞蛋白表达体系的运用

生物制药工程中无细胞蛋白表达体系的运用

徐 瑛

多多药业有限公司 黑龙江 佳木斯 154007

摘要：过去的蛋白质表达系统在制药过程中虽然也有出色的表现，但这一技术存在生理局限性。例如，在蛋白质表达过程中，降解需要花费很长的时间，同时对下游产品的处理也有很高的要求。结果是，导致生物药物价格上涨的原因是长期没有对其进行技术改进。但是，无细胞蛋白在应用过程中并没有水溶性和半衰期的缺陷，无疑更有利于制药工业的发展。

关键词：生物制药；无细胞蛋白；技术进展；应用措施

前言

随着科技的日臻成熟，无细胞蛋白表达系统因其成本低廉、操作简单而在业界广受好评。特别在生物制药领域，能在体外有效地合成蛋白质，比传统的蛋白表达方式更省时省力。在此基础上，作者首先对无细胞蛋白的两种常见表达形式进行了简要阐述；其次，介绍了近年来在该技术方面的重大突破；最后，对无细胞蛋白的几种应用方法进行了综述。

1无细胞蛋白表达体系的分类

1.1原核系统

原核系是指通过对原核生物的辅助，来提取细胞蛋白产物。一般情况下，原核生物具有很强的耐受性，因此与传统方法相比，在蛋白表达方面的稳定性得到了保证。实践中，技术人员首先对目标蛋白质的各项参数进行了分析，确定了合理的添加方案。近几年，制药行业大量使用像大肠杆菌这样的原核生物，它不仅表现出更好的表达效果，而且还大大降低了药物的成本损耗。尽管如此，原核生物的内部结构还是比较简单的，所以能够携带的信息也比较有限。

1.2真核系统

除原核系统外，真核系统在蛋白质表达系统中也有广泛应用。正如其名称所示，该技术使用真核生物进行表达，可以提供更丰富的信息。同时，真核系统也不受原核系统的非特异性抑制，因此，最终参与表达的效应也远超预期。实际上，技术人员可以将模版转换成一种线性结构，从而大大提高了蛋白质的稳定性。许多实验表明，原核、真核系统在蛋白质表达方面的合成产出都是相当可观的，但二者又各有其特点和优点。所以，在应用上还需要结合目标蛋白的性质，合理地选择表达方式。

2无细胞蛋白表达体系的新进展

2.1稳定性大幅提高

蛋白质生物制药中，提取液的稳定性一直是一个重要的技术指标。但在常规的蛋白质表达体系中，反应过程中易产生局部抑制，这将严重阻碍蛋白质表达的进一步发展。而且，在无细胞表达系统的研究初期，由于没有能够解决内部代谢问题，也使制药的成本更高。而且由于工业和学术上的持续努力，使得提取物的代谢问题得以缓解。实验结果表明，在提取物中既有磷酸化反应的发生，又有能量网络的存在。这样，无细胞表达也就得到了充分的代谢支持，使得生产得以有效地进行。此外，针对抑制产物的问题，还提出了一些有效的解决方法，使目标蛋白质的稳定性有一定程度的改善。例如，一些企业直接在生产过程中加入麦芽糖，这不仅能提供大量的能量，而且还能消耗无机磷。或者是直接针对降解酶进行清除，从而保证氨基酸在反应中的效率。

2.2表达蛋白的折叠

传统的蛋白质表达体系中，相邻区域之间很容易发生相互作用，使不同疏水环境下目标蛋白受到一定的破坏。例如，该区域的化学环境发生了变化，蛋白质的结构受到威胁，甚至在其他反应中也有可能涉及。所以，折叠过程中必须考虑到隔离性保护。例如，技术员可以在工艺中加入铁硫簇来加快二硫键转变。但是，没有细胞表达就不会有这样的问题，可以直接在同一区域进行合成，无疑使制备过程更简单和可行。技术员可以在使用 DsbC时将少量的酶抑制剂添加到抽提物中，从而形成二硫键。蛋白折叠过程中，多糖还能促进蛋白的结合。例如工业上常用的纳米凝胶，可以明显地减少链的释放，避免折叠时产生的沉淀问题。通过这些关键技术的集成，使得无细胞表达系统在合成目标蛋白时更加经济有效，但合成效率却比以前有了很大提高。

3无细胞蛋白表达体系的应用

3.1非天然氨基酸的开发

常规蛋白主要是天然合成的，虽然在医学上也有重要作用，但一直难以适应技术发展的需要。例如天然蛋白质的结构趋向于固定，因此它的功能也显示出一种特性，在生物医药领域仍然存在着明显的不足。近年来，业界开始尝试对蛋白质进行改良和修饰，以使目标蛋白的生物学特性与生产要求更加吻合。在蛋白质表达过程中，部分企业添加了一些非天然的氨基酸，它们可以在序列中与原始氨基酸共价结合。经临床验证，使用非天然氨基酸合成的蛋白质，使用起来更为方便，同时也能显著提高药物的耐受性。特别是现在，需要大量的药物应用到蛋白上，这就需要无细胞表达技术的支持。

3.2复合体的表达

复合物合成也是无细胞系统的一个重要组成部分，在疫苗和其他药物的生产中有良好的作用。该药是一种抗原抗性物质，它通过模拟病毒刺激人体免疫反应而产生。与此同时，为确保模拟药物不会在人体内传播，还必须确保它们不包含病毒基因物质。没有细胞表达的技术正好满足这一要求，可以直接产生病毒蛋白，而病毒蛋白的内容是空心的。例如，在生产类病毒颗粒的企业中，大量使用无细胞表达系统。在二硫键的作用下，技术人员首先控制合成过程中的氧化反应，然后调控合成过程。该技术的应用，在保证疫苗检测过程安全性、可靠性的同时，还能及时产生抗性。

3.3靶标膜蛋白表达

这些基因中大部分都属于膜蛋白，所以它们在药物靶向上都有很好的作用。这一技术的推广应用，对提高无细胞表达系统的膜蛋白合成水平具有重要意义。然而，由于膜蛋白本身的特性，在实际应用中还存在一些技术难题。其中一个原因是，在合成膜蛋白过程中，如果不能控制好用量，就会产生沉淀。这种现象具有一定的毒性，给病人带来了安全隐患。二是膜蛋白折叠也比较困难。人工脂质需要在操作中加以处理，使其生成活动能够有序地进行。另外，膜蛋白的人工脂质加工也是其中的一个技术重难点，更加剧了其实施的难度。特定应用中，技术人员应利用去污剂等建立良好的合成环境，促进蛋白质的产生。

3.4高通量蛋白表达

近几年来，从生物制药的发展趋势来看，高通量蛋白的药效越来越突出，其应用范围也逐渐扩大。在此之后很长一段时间内，高通量蛋白质一直是业界和学界研究的重要课题。但是，传统的蛋白质表达系统在合成中效率低下，给这一技术的普及和推广带来一定的困难。与之相反，无细胞蛋白表达似乎更具先天优势。例如，在合成过程中，无细胞表达不需要通过基因克隆来简化合成流程。另外，合成高通量蛋白质也可以借助芯片的控制，使合成过程更加可控。值得注意的是，在高通量蛋白质中，膜结构无需参与反应。对于无细胞表达系统，一旦发现异常情况，技术员可通过外界干扰及时纠正，规范合成。

结语

总而言之，随着生物制药技术的不断成熟，蛋白质表达系统的应用也越来越广泛。特别是无细胞系统，由于其操作简单，成本较低，必将成为业界应用的主流技术。根据近年来无细胞表达的技术突破，作者认为非天然氨基酸、复合物、膜蛋白和高通量蛋白在表达方面具有优势。期望通过本文的研究，能促进我国无细胞表达系统的发展，为我国的医学事业做出应有的贡献。

参考文献

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