探究芳樟醇对大肠杆菌的抑菌作用机制

探究芳樟醇对大肠杆菌的抑菌作用机制

阮关强

浙江中纺标检验有限公司，浙江 绍兴 312000

摘要：目前，国内外学者对植物精油的抗菌活性成分及作用机理进行了大量研究。精油液的抗菌机理主要从细菌微观结构、细胞膜通透性和细胞代谢的变化来理解，而芳樟醇在气相中的抗菌活性和机理研究较少。樟树的精油是从香樟枝叶中提取的。芳樟醇是一种成分复杂、含量低的化合物。对大肠杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌、链球菌等病原体有一定的抑制作用。在此基础上，分析讨论了芳樟醇对大肠杆菌的抑菌机理。

关键词：芳樟醇；大肠杆菌；抑菌作用机制

芳樟醇等萜烯类化合物对大肠杆菌、变形杆菌、肠杆菌、葡萄球菌、酿酒酵母、白球菌、黑曲霉、琼脂等具有良好的抗菌活性。从臭氧和臭氧制备了芳樟醇臭氧化物，在试管中显示出对大肠杆菌具有抑制活性。

1 芳樟醇的主要来源及制备方法

芳樟醇的来源可以是合成路线，也可以是丰富的天然精油。但在天然樟树杂交种植过程中，芳樟醇的含量不高，杂质(主要是樟脑)含量不低。因此，可透过综合分离过程取得合资格的产品。能源消耗、劳动力消耗和材料消耗增加了成本。因此，自然资源不能满足日益增长的市场里程需求。

1.1 主要来源

第一，它来自各种富含百合油的天然精油，如樟脑油、樟脑叶油、加洛马油、红木油、木兰油、香荽油等。通过单一的细滑；第二，半合成的；第三，都是合成的。樟科的许多品种都含有百合，但由于种植过程中的杂交，精油中百合的含量有所不同。红木精油是亚马逊河流域的野生常绿树，主要由亚麻醇组成（总酒精含量为82%)组成，其他成分包括艾丁烯、二戊烯、丁香酚、内洛醇等），它是提取亚麻醇的优良原料。

1.2 制备方法

可以用芳香油、樟脑油、花梨木油、伽罗油等精油为原料，通过分馏，也可以用化学方法合成。目前，从松节油中合成芳樟醇主要有两种方法：

⑴β-蒗烯高温裂解为月桂烯，经盐酸化、酯化、皂化制备芳樟醇。通过该方法生产的其他醇包括橙花醇、香叶醇、月桂醇和萜品醇。这种方法的收率较高。

(2)α-蒗烯氢化至蒗烷,然后氧化为蒗烷氢过氧化物，再还原为蒗烷醇，最后热解为芳樟醇。

2 芳樟醇对大肠杆菌的抑菌测定方法

2.1 菌株活化

大肠杆菌在37℃营养琼脂培养基中接种180r/min，活化18到24小时。用0.9%的生理盐水冲洗菌体形成菌悬液，菌液浓度调节至1×105~106CFU/mL。

2.2 ATP含量测定

将细菌悬浮液加入含有1×MIC和2×MIC芳樟醇的培养基中，使用无菌水和1%DMSO作为空白和阴性对照。提取的菌悬液以6000r/min离心10min、采样间隔2h、0.01mol/lPBS洗涤3次后悬浮。复苏菌经低温超声粉碎（功率300W，间隔1.1s），8000r/min离心10min。丢弃细胞残渣，取上清液。用ATP含量测定箱测定ATP含量。

2.3 最小抑菌浓度（MIC）测定

用1% 的二甲基亚砜稀释至25、50、100、200升/ml，供日后使用。在片剂中加入2mL不同浓度的琼脂，然后将18mL营养琼脂培养基冷却至50℃，最终浓度分别为2.5、5、10、20µL/mL。空白对照和阴性对照分别为2mL无菌水和1% 二甲基亚砜。培养基完全固定后，将200升大肠杆菌稀释至1105-106菌落形成单位/毫升。经均匀包衣后，倒置37℃培养24小时。以最小抑菌浓度(MIC）为最小浓度，24小时内未见菌落形成。

2.4 核酸浓度测定

细菌悬浮液经活化后培养至对数期，6000r/min 离心10min。去除上清液，沉淀细菌，加入含1微克和2微克亚麻醇的生理盐水中。以无菌水和1% 二甲基亚砜为空白对照和阴性对照。采样时间间隔为3h。将提取的细菌悬浮液用6000r/min 离心10min。上清液在260nm 处测量光吸收值。

3 芳樟醇对大肠杆菌的抑菌分析

3.1 最小抑菌浓度分析

表1 大肠杆菌最小抑菌浓度

供试菌	对照组		芳樟醇浓度/（mL/L）
	无菌水	1%DMSO	2.5	5	10	20
大肠杆菌	+++	+++	+	-	-	-
注：-表示无菌落；+表示有较少菌落；+++表示大量菌落

由表1可以看出，芳樟醇对大肠杆菌有明显的抑菌作用，且随芳樟醇浓度的增加抑菌作用增强。当浓度为5mL/L时，大肠杆菌无菌落生长，当浓度为2.5mL/L时，大肠杆菌的最小抑菌浓度为5mL/L。

3.2 芳樟醇对大肠杆菌核酸泄露的影响

随着培养时间的延长，由于细菌的正常生长和凋亡，无菌水组和1%DMSO组的核酸渗漏量增加。在260nm 处，1×MIC的光吸收值从0.177增加到0.948,2×MIC从0.058增加到1.173，表明细胞内有大量浸润。这些结果表明，质膜可能会发生不可逆的损伤，导致细胞组分如DNA和RNA的基本分子丢失，从而导致细胞死亡。

3.3 芳樟醇对大肠杆菌细胞膜膜电位的影响

加入抗菌物质后，1×MIC的平均荧光强度在2小时内由4372.90Au下降到649.65Au。当浓度为2×MIC时，平均荧光强度降低了3594.9145Au。这可能是由于芳樟醇处理对大肠杆菌细胞膜的结构和功能的影响，导致细胞膜的电位下降，细胞去极化，影响ATP的产生，并导致代谢异常。

3.4 芳樟醇对大肠杆菌ATP含量的影响

ATP是细菌细胞中的能量因子，为大肠杆菌的新陈代谢和活力提供能量和力量。根据芳樟醇对大肠杆菌ATP含量的影响，无菌水组和DMSO组ATP含量无显著变化，实验组ATP含量显著下降，在经过4小时，1×MIC的ATP含量仅为18.46μmol/L。然而，2×MIC的ATP含量低至9.91μmol/L，这表明添加芳樟醇对细菌ATP的合成或消耗有影响。

3.5 芳樟醇对大肠杆菌生长的影响

细菌在液体中的浓度可以通过600nm 处的光吸收值反映出来。光吸收值越高，细菌浓度越高，可以反映樟脑对大肠杆菌的抑制作用。空白对照组和阴性对照组细菌呈典型的“S”型生长，表现良好。0.2×MIC组与空白组和阴性对照组相比，OD值是明显增加的，1×MIC和2×MIC组几乎没有变化，这表明芳樟醇可以有效地减缓甚至完全抑制细菌生长。

3.6 芳樟醇对大肠杆菌胞内蛋白含量的影响

有机大分子蛋白是细胞的基本有机质，也是生命活性的关键元素。随着培养时间的增加，无菌水组和1%DMSO组增加，1×MIC和2×MIC组由于细胞破坏和蛋白质的含量溢出，细胞内蛋白含量在1-6h内急剧下降至394.99µg/mL，2×MIC组蛋白含量的降低比1×MIC快，表明芳樟醇对大肠杆菌细胞壁和细胞膜有破坏作用，随着芳樟醇浓度的增加，芳樟醇对细菌的破坏影响更大。

4 结论

芳樟醇对大肠杆菌的抗菌性比较强，MIC和MBC分别为200μL/L。在气相熏蒸过程中，细胞壁的完整性受损，细胞膜更多地暴露在气相中，导致长链饱和脂肪酸的减少，合成生物膜中不饱和脂肪和短链脂肪酸的增加，以及细胞膜的流动性。同时，它导致细胞膜蛋白三级结构的变化，破坏细胞膜的完整性。芳樟醇会导致细胞膜的脂质组成和膜蛋白结构的改变，增加细胞膜的渗透性，并导致一些小分子如盐和磷酸盐，以及维持细胞正常生长的蛋白质、DNA、RNA的泄漏，并最终导致大肠杆菌的死亡。

参考文献：

[1]张赟彬,刘笑宇,姜萍萍,等.肉桂醛对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌作用及抑菌机理研究[J].现代食品科技,2015,31(5):31-35

[2]吴克刚,赵欣欣,段雪娟,等.芳樟醇气相抗菌活性与作用机制[J].食品科学,2020,41(1):61-67.