白及抗炎活性成分 富集及活性测定

张林瑜，王佳茂 ， 韦永华，王炎， 陈宇，李美芽，蒋福升 *

浙江中医药大学，浙江 杭州 310053

摘要 目的：富集制备白及抗炎活性部位，测定其抗炎活性。方法：以聚酰胺柱色谱乙醇梯度洗脱法富集白及抗炎活性成分，并采用LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症模型测定其抗炎活性。结果：白及醇提取物与聚酰胺按重量比1:4混合，减压浓缩至无醇味，混悬物装柱，20%乙醇洗脱去杂，收集40%乙醇洗脱物，减压干燥得白及药效部位。该药效部位可剂量依赖性抑制LPS诱导的RAW264.7细胞IL-6和TNF-α表达，表现出较好抗炎活性。结论：聚酰胺柱色谱法对白及抗炎活性成分具有较好富集作用，所制备的药效部位具有较强的抗炎活性，这为今后白及开发利用奠定了良好基础。

关键词：白及；聚酰胺；抗炎；高效液相色谱法；药效部位

中药白及（Bletilla striata）为兰科植物白及的干燥假鳞茎，具有收敛止血、消肿生肌等功效，对肺部、消化道出血及皮肤损伤等疾病具有较好疗效^[1]。白及富含多糖，具有止血、促损伤修复等作用，是较为公认的药效成分^[2]。但近年来，有关白及醇提物药理学研究报道日渐增多，并且抑菌、抗炎等活性显著优于多糖^[3]。前期我们以LPS诱导的RAW264.7炎症模型为指导，从白及中分离鉴定了贝母兰宁、山药素Ⅲ和3'-O-甲基山药素Ⅲ等几个具有较强抗炎活性单体成分^[4]；而且不同产地白及含量测定表明，三个成分含量最高分别达0.116%、0.386%和0.086%^[5]。虽然上述各单体成分均具有不同程度的抗炎活性，但以单体开发与现有上市抗炎药物相比并没有优势，另外纯化单体化合物难度大成本高也难以达到产业化要求。鉴于中药具有多成分、多靶点、协同互作等特点，因此，富集一个成分基本清楚，具有稳定抗炎活性的白及活性部位是当前较为可行的方案。所以，结合前期工作基础，本文拟采用聚酰胺吸附色谱法对白及主要抗炎活性成分进行分离、富集，并对其抗炎活性进行测定，现报道如下。

1 仪器和试剂

1.1 实验细胞株

RAW264.7巨噬细胞，购自上海中科院细胞库。

1.2 主要实验试剂

白及，采自湖北省武穴市梅川镇，经浙江中医药大学丁志山教授鉴定为白及（Bletilla striata）；贝母兰宁、山药素Ⅲ和3’-O-甲基山药素Ⅲ实验室自制，纯度≥98%；色谱纯乙腈和甲酸，美国J.T.Baker公司；95%医用乙醇，杭州禾德化工有限公司；聚酰胺（100-200目），台州市路桥四甲生化塑料厂；DMEM培养基和胎牛血清，Gibco公司；小鼠IL-1β CBA试剂盒和小鼠炎症因子CBA试剂盒，美国BD公司。

1.3 主要实验仪器

戴安UltiMate3000高效液相色谱仪（美国戴安公司）；CO₂培养箱（Thermo fisher scientific公司）；BD Accuri^TM C6流式细胞仪（美国BD公司）。

2 实验方法

2.1 聚酰胺富集条件优化

2.1.1白及有效成分提取

白及切片、晒干、打粉，过40目筛，称取500 g，用十倍量95 %乙醇回流提取三次，每次半小时，合并滤液，减压蒸干得白及95 %乙醇提取物。

2.1.2 色谱条件

采用高效液相色谱法对白及中有效成分进行定量分析，色谱条件参照先前文献报道方法^[4]。

2.1.3静态吸附条件考察

称取100-200目聚酰胺50 g，60 ℃烘至恒重。称取1 g白及95%乙醇提取物，用100 mL 50 %乙醇溶解配成10 mg/mL母液。以贝母兰宁、山药素Ⅲ、和3'-O-甲基山药素Ⅲ吸附率为指标，考察不同乙醇浓度（5 %、10 %、15 %和20 %）和不同聚酰胺比例（白及提取物重量/聚酰胺重量=1:0、1:1、1:2、1:3和1:4）条件对三个成分吸附率；其中，白及提取物吸附处理浓度均为1 mg/mL。各处理组室温摇床振荡吸附处理4 h时间，然后各取上清液5 mL，减压蒸干，用0.5 mL 80 %乙醇溶解，12 000 rpm离心10 min，进样10 μL作HPLC分析。根据下述公式，计算比较不同条件下的聚酰胺静态吸附率。

2.1.4不同比例聚酰胺吸附后洗脱率考察

分别取10 mg/mL的白及95%醇提物母液，以1:0、1:3、1:4、1:5加入100-200目的聚酰胺，并加水稀释到1 mg/mL，减压除去乙醇，补加水至原来的体积，室温摇床振荡吸附4 h；混悬物装柱，先用水洗至流出液无色，再用95%的乙醇洗脱至无色，收集各洗脱液体，减压蒸干，水和95%乙醇洗脱物各用10 mL 80 %乙醇溶解，各取1 mL 12 000 rpm离心10 min后直接进样10 μL作HPLC分析，按下述公式计算洗脱率：

2.1.5最佳乙醇洗脱浓度考察

取900 mg样品以30 mL 80 %乙醇溶解，均分3份，每份各加入1.2 g聚酰胺，减压蒸去一半后补加至20 mL水，最后减压蒸至大约10 mL，确定无醇味，混悬物装柱依次用水、20 %、40 %和60 %乙醇洗脱，收集各洗脱液，减压蒸干，用80 %的乙醇溶解最后稀释成10 mg/mL，各取1 mL 12 000 rpm离心10 min后进样10 μL作HPLC分析。

2.2 白及药效部位制备

称取白及粉（40目）500 g，分别用10倍量、8倍量和6倍量95%乙醇回流提取3次，合并滤液；取50 mL滤液减压浓缩蒸干，称重并计算总滤液中干物质总重，然后加入4倍95%乙醇提取物重量的聚酰胺（100-200目），45 ℃减压浓缩一半体积，然后再边摇边加入500 mL蒸馏水，并继续减压蒸至无醇味，混悬物装柱，依次用水、20 %乙醇、40 %乙醇洗脱，收集40 %乙醇洗脱部分，减压蒸干得白及药效部位。

2.3 白及药效部位对炎症因子抑制作用

RAW264.7细胞，接种96孔板，24 h后加入不同浓度药效部位预处理，1 h后加入终浓度为200 ng/mL的LPS进行刺激，12 h后吸取上清50.0 μL，根据BD-CBA小鼠炎症因子检测试剂盒操作步骤，采用BD Accuri^TM C6流式细胞仪测定IL-6和TNF-α炎症因子水平，每个处理3个重复。

2.4 统计学分析

各数据均以 ±s表示，采用SPSS19.0软件进行统计学分析，各组间比较采用一维方差分析，P<0.05表示有显著性差异，P<0.01表示有极其显著性差异。

3 实验结果

3.1 静态吸附条件考察结果

从图1中可以看出，随乙醇浓度增加，贝母兰宁、山药素Ⅲ和3’-O-甲基山药素Ⅲ在聚酰胺上的吸附率均显著下降（P<0.05）；相对而言，5%乙醇浓度条件下吸附率和无乙醇条件下吸附效率较为接近；因此，无醇条件下，较有利于聚酰胺对上述3个化合物的吸附。在不同乙醇浓度吸附条件下，吸附率均随聚酰胺比例增加而增加；其中，在无醇吸附条件下，贝母兰宁在物料比1:1时吸附率即可达84.64%，但山药素Ⅲ要在1:2（84.64%），3’-O-甲基山药素Ⅲ要在1:3（84.38%）时吸附率才高于80%。值得注意的是，在5%乙醇吸附条件下，物料比达到1:4时，相比物料比1:3时聚酰胺对3个化合物的吸附率均有非常显著的提高，且此时吸附率与无醇吸附条件下物料比1:4时相当（P>0.05）。总体而言，吸附时保持乙醇浓度在5%以下有利于提高聚酰胺吸附效率，无醇条件下最优。

图1 不同乙醇浓度、不同物料比各主要成分吸附率

注：*表示相同乙醇浓度条件下，其它物料比组与1:1物料比组比较具有统计学差异，P<0.05；#表示相同物料比条件下，其它乙醇浓度组与0%乙醇浓度组比较具有统计学差异，P<0.05。

3.2 不同比例聚酰胺吸附后洗脱率考察结果

从图2a中可以看出，随物料比增加，总体上3个成分洗脱率均有所下降，即死吸附量增加；其中贝母兰宁和3’-O-甲基山药素Ⅲ两个物质洗脱率在物料比1:4时与1:1时比较具有显著性差异（P<0.05），其他各组间无显著性差异。不同物料比情况下，3个化合物洗脱率总体上都超过96%，说明这3个物质在聚酰胺上的死吸附量总体较低。从上述结果可知，随物料比增加，聚酰胺对各物质吸附量增加，但同时死吸附量也增加；物料比从1:3增加到1:4，贝母兰宁、山药素Ⅲ和3’-O-甲基山药素Ⅲ 3个化合物吸附量平均增加量分别达2.23%、3.83%和4.92%，死吸附量分别增加了0.64%、0.62%和0.51%（见图2b）；考虑到聚酰胺的可重复回收利用这一特点，确定物料比1:4较为合适，有利于白及各成分均匀吸附和洗脱。

图2 不同物料比各物质洗脱率（a），物料比1:3增加到1:4时吸附量和死吸附量增加情况（b）

注：a中“*”表示与1:1物料比组比较具有显著性差异，P<0.05；b中与对应吸附量增加百分比值比较，“*”表示有显著性差异，P<0.05；“#”表示有极其显著性差异，P<0.01。

3.3 最佳乙醇洗脱浓度考察结果

样品经聚酰胺吸附后梯度乙醇洗脱，HPLC分析结果如图3所示。通过各峰紫外光谱比较，发现20%乙醇洗脱物中含有少量山药素Ⅲ，而贝母兰宁和3’-O-甲基山药素Ⅲ对应出峰时间均未见明显峰；其中在贝母兰宁（1号峰）前有一个

图3 不同乙醇洗脱部位HPLC图

注：a、b和c分别为20%、40%和60%乙醇洗脱物；1-3分别为化合物贝母兰宁、山药素Ⅲ和3’-O-甲基山药素Ⅲ，4、5号峰为未知物。

4号峰，出峰时间上和贝母兰宁有一定差异，同时紫外光谱和贝母兰宁有明显差异（图3a4和b1），说明并非贝母兰宁。60%部分有少量贝母兰宁，无明显3’-O-甲基山药素Ⅲ峰（3号峰），但山药素Ⅲ（2号峰）对应保留时间有一明显峰，通过比较紫外光谱（图3b2和c5）可以发现，两者紫外光谱完全不同。因此，贝母兰宁、山药素Ⅲ和3’-O-甲基山药素Ⅲ三个目标化合物主要富集于40%乙醇洗脱部位（见图3b），富集效果良好。

3.4 药效部位对LPS诱导的RAW264.7细胞炎症因子表达抑制作用

从图4结果可以看出，白及药效部位处理后可剂量依赖性抑制IL-6和TNF-表达，且对IL-6抑制作用显著强于TNF-。其中30 μg/mL处理时对IL-6和TNF-的抑制率分别达71.04 %和21.21 %。

图4 EFBS对各炎症因子表达抑制作用

4 分析与讨论

聚酰胺分子中含有大量酰胺基团，可与酚类、硝基类和醌类等化合物形成氢键互作而被吸附，因此常用于黄酮类物质的分离富集^[6]。白及中含有较多的菲类和联苄类化合物，这类成分往往带有酚羟基^[3]，因此，理论上可以通过氢键作用而吸附，并与其他不宜吸附杂质实现分离。从上述结果看，聚酰胺柱色谱确实对白及中菲类、联苄类具有很好的富集效果。聚酰胺在不同溶剂中对酚类物质的吸附能力存在较大差异，一般来说水溶液中吸附能力强，醇溶液中吸附能力弱，并随醇浓度升高吸附力减弱。上述研究结果也证实，随溶解样品乙醇浓度增加，三个目标组分吸附率依次下降，相对而言，控制乙醇浓度在5%以下有利于三个目标组分的吸附。在吸附量上，随聚酰胺比例增高，对三个目标组分吸附率在不同乙醇浓度条件下都显著提高（见图1），但对应洗脱率则会有所下降，在充分考虑吸附率和洗脱率情况下，白及乙醇提取物和聚酰胺比例为1:4较为合适。

聚酰胺柱色谱一般先溶解样品再上柱洗脱，其中样品溶解浓度、体积、上样流速及洗脱速度等各因素都需要进行合理控制。在实际操作中，很多样品脂溶性较强，往往需要一定浓度乙醇助溶，样品浓度低且体积大，上样困难。增加乙醇用量能够提高样品浓度，减少体积，但影响聚酰胺对样品吸附力。因此，我们采用类似“干法上样”方法，将样品用较高乙醇溶液溶解，然后减压去除乙醇，只留下水时，在除醇过程中让物质慢慢吸附在聚酰胺上，由此可以省去提取物浓缩后重新复溶、上样过程。通过实验优化，建立了白及醇提物聚酰胺柱色谱吸附和洗脱方法，简化了实验操作，获得了白及抗炎药效部位，该药效部位对IL-6和TNF-α均具有抑制活性，且抗炎活性与其单体成分作用类似^[4]。因此，本研究为进一步深入系统研究白及药效成分抗炎机制奠定了良好基础，也为中药白及开发利用提供了依据。

参考文献

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[2] 罗熠. 白芨多糖在皮肤愈伤和肺纤维化治疗中的应用[D]. 南京:南京大学,2009.

[3] He X, Wang X, Fang J, et al. Bletilla striata: Medicinal uses, phytochemistry and pharmacological activities[J]. J Ethnopharmacol,2017,195:20-38.

[4] 邓延珍. 基于RAW264.7巨噬细胞炎症模型探讨白及抗肺纤维化活性组分及分子机理[D]. 杭州:浙江中医药大学,2017.

[5] 蒋福升，沈徐婷，姚玥，等. 不同来源白及中3个主要化学成分的含量比较[J]. 中国中药杂志,2019,44(13):2762-2767.

[6] 甘春丽，王晶，杨异卉，等. 聚酰胺柱色谱法分离黄酮醇与二氢黄酮醇类化合物[J]. 哈尔滨医科大学学报,2007,41(6):552-554.

基金项目：浙江中医药大学2020年学生科研基金项目（88）

作者简介：张林瑜（1999-），女，本科在读，生物科学，E-mail：1448225423@qq.com

*通讯作者：蒋福升，副研究员，研究方向：中药药理与新产品开发，0571-86613666，E-mail：jfs1020@163.com