基因组学技术对于原核微生物物种概念的推动作用

基因组学技术对于原核微生物物种概念的推动作用

欧阳晶颖

中南大学 410006

【摘要】物种概念是一个充满争议的问题，其中至少存在24种有分歧的物种概念被不同研究方向的生物学家提出，依据其不同的物种概念，物种的界定以及物种的数量会出现很大的差异。学者们普遍认同的观点是：物种是进化分离的微居群谱系。在物种分离的过程中获得的谱系特征如生殖隔离、可鉴定性、单系统发生都可以作为鉴定其次级特征的不同方式。随着物种分析技术的发展与操作的不断改进，原核微生物物种的概念也有其自身的发展进程。

【关键词】基因组、原核生物、物种

近现代以来，生物分类学中讨论的热点话题中一直都有物种概念及物种的划分。1923年出版了“伯杰的细菌鉴定学手册”，首次提出了一种现代的细菌鉴定分类标准。虽然当时对原核微生物的分类还没有共识，但是该手册的后续版本为之后的分类学发展提供了一个框架。

在微生物分类学家中，人们普遍认为目前使用的物种概念在原核生物世界中不仅是用的，而且具有实用性和普遍适用性。物种可被描述为“与单个和基因组相关的个体生物群体，是在许多独立特征中显示出高度的整体相似性，并且可以通过辨别性的表型特征进行诊断”[1]。

原核生物分类是生命组织中不同分类中最新和最实时的。因为它们体积小，并且通常无法用肉眼看到它们，所以几个世纪以前，人们甚至无法发现原核生物的存在。与真核微生物不同，根据原核生物的相对简单性，开发了一种基于形态学特征的可靠分类。但是由于缺乏可靠的化石记录，也缺少鉴定这些微小生物的诊断特征，造成了原核生物分类系统的不稳定性。了解原核微生物的表型特征和基因组关系的新技术是原核微生物生物分类学发展的关键。

1.原核微生物分类的发展

随着表征细菌的不同方法的出现，使得细菌分类学家更加难以客观概述这些分类方法。

20世纪50年代后期，数字分类学与计算机的发展作为多变量分析的一部分，该技术的目的是设计出一套统一的生物分类方法，将大量菌株的生理、生化以及其他性质的数据处理进行处理，以此获得细菌学数值分类学的发展动力。因此，更需要一种客观的分类学分析方法，为的是将单个细菌菌株分类[2]。数值分类法出现的时期恰好是生化分类和现代生化分析技术的热门阶段,主要是利用色谱和电泳分离方法在特定化学成分，如：氨基酸，蛋白质，糖类和细菌中的脂质的分布研究中的应用相吻合。

在20世纪60年代早期，越来越多的DNA特性知识和分子生物学技术的发展支持了这样一种观点，利用它们的基因组数据，进行分析比较来分类细菌。最初，使用DNA的总碱基组成（mol％G + C值）。其摩尔％G + C值出现明显偏差的细菌不属于同一物种。然而，仅分析DNA碱基组成是一种非常单一片面的方式，要保证分析的准确性就需要更精确的方法。因此，开发了DNA ^ DNA杂交技术[3]。这种方法的一个很大的现实优点是它经常产生明确的菌株簇，而不是那些仅受表型特征限制的菌株。因此，DNA ^ DNA杂交技术成为细菌物种限制的标准技术。它们的实用性体现在之后确定的可用于描述DNA相似性的表型特征，以及确定哪些表型特征可用于高效、快速、可靠地鉴定新的分离株[1]。

在20世纪70年代后期，通过编目核糖体核糖核酸（rRNA）和DNA ^ RNA杂交[4]。以及在20世纪80年代中期的通过全序列分析，在尝试确定远缘相关细菌之间关系方面取得了显着的突破。rRNA序列被证明是用于系统发育分析的非常有用的分子标记[5]在三种rRNA分子中，16S rRNA的研究是最广泛的。因此，大多数信息可用于该分子[6]。16S rRNA测序的时代带来了新的信息，例如最终识别古细菌或是将古细菌作为独立的细胞谱系[7]，以及原核分类方案的重要重排[8]。在大多数的微生物实验室中，rRNA测序已经很常见，即使其不被认为是新分类所必需的，但是大多数新分类的细菌物种的描述中需要rRNA的测序信息。然而不幸的是，16S rRNA的分辨能力难以正确描绘出细菌物种之间的关系[9]。此外，它作为系统发育推论标记的有效性受到质疑[10-12]。

尽管如此，目前绝大多数细菌分类学家都认为16S rRNA序列分析为原核分类提供了一个稳定且令人满意的框架。然而，人们也普遍认为，当采用“多相方法”[13]时，可以实现对原核生物的充分分类，有其是物种等较低的分类学等级[13]。在进行物种分类的过程中尽可能运用到不同的技术，这包括对分类环节的调整以及对不同细菌群差异性的考虑。

2. 利用基因组信息检索界定原核微生物的方法

基因组信息检索的方法主要针对DNA或RNA分子。这些方法目前在现代分类学的研究中占据着主导地位，不仅仅是因为技术的进步的结果，而且是因为目前的观点认为，分类应该拒绝DNA中编码的基因型关系[13]。与其他用于化学分类学的细胞成分不同（参见第2.1.1节），其影响参数只有RNA和染色体DNA的数量，且不是由生长条件所能决定的，因此不依赖于环境变化。此外，核酸是普遍分布的，这些是极好的工具，可以作为广泛比较的标准。

整个细菌基因组能包含最完整的基因组信息来源。但是对全基因组进行大规模测序在目前来看是不可行的，因此需要采取了几种替代方法。这几种方法有：估算DNA的平均总碱基组成，通过DNA ^ DNA配对的研究进行基因组的相似性比较，通过限制性内切酶消化产生独特的DNA片段(低频限制片段分析（（LFRFA））, 脉冲场凝胶电泳（（PFGE）），RFLP) ，选择基因的序列比较，DNA ^ rRNA杂交和rRNA的测序[1]。

2.1.DNA碱比（mol％G + C; G + C含量; G + C％）

DNA的一级结构是由四个核苷酸碱基：腺嘌呤（A），胸腺嘧啶（T），鸟嘌呤（G）和胞嘧啶（C）的线性连续，并且这种连续决定了生物体基因组的遗传信息[14]。由于DNA的双链性质，其中两条链与碱基依照G-C和A-T进行互补配对，比率G / C和A / T的比率通常保持恒定在1。但是，相对比率[G + C] / [A + T]因基因组而异。DNA分子的碱基比率通常被描述为G + C对的相对丰度，通常称之为G + C含量。 DNA碱比率以G + C的百分比计算，即：[G + C] / [A + T + C + G]≤100。这是第一个应用于原核生物系统学的核酸技术，最初被证明是区分表型相似但基因组不同菌株的有用和常规方法[15]。它通常是首推的用于物种和属的描述的基因组特征之一。

在原核生物中，G + C含量在20-80mol％之间变化[16]。两种生物之间的差异越大，它们之间的相关性就越小。从理论上讲，差异大于20-30 mol％的DNA分子几乎没有共同的序列[17]。已经证明，超过10 mol％的生物不属于同一属，并且5 mol％是物种内的常见范围。虽然对变异的范围还没有明确的指导方针，但高于15 mol％的值可以作为属内异质性的一个强有力的指示。然而，应该指出的是，虽然mol%的差异在分类学上对于组的分离是有用的，但是碱基组成的相似性并不一定意味着物种之间具有密切的关系，因为测定时没有考虑DNA分子中碱基的线性序列（该测定标准只能在否定中使用）。

2.2.RNA分析

在过去的25年中，涉及rRNA分析或编码rRNA（rDNA）的基因的技术已经彻底改变了原核生物的分类学。从这些研究中得出的结论是基于假设：由于核糖体在蛋白质合成中的基本作用，rRNA基因是高度保守的[21]。 rRNA是具有通用、恒定和高度约束功能的分子，其创建在进化的早期阶段并且不受生物体环境变化的影响。正是由于它们是含有大量遗传信息的大分子，所以选择它们在原核生物世界中作为重建系统发育的分子基础。该方法的有效性还需要另外两个假设，即rRNA基因之间没有发生横向基因转移，以及给定的一对生物体的rRNA序列之间的进化量或代表差异的基因组所显示的变异。如果这是真的，原核生物中rRNA初级结构的变化将反映生物之间的进化距离。

这三种rRNA在超速离心过程中的沉降系数分别为23S，16S和5S。它们的链长分别为约3300,1650和120个核苷酸。直到现在，将较大的rRNA分子的直接或完全测序作为常规方法仍然不可行。但是，可以通过DNA ^ rRNA杂交来间接分析序列数据，或通过寡核苷酸编码获得部分序列[4]。起初，对于原核生物，5S rRNA的完整测序被用于系统发育推断。由于各种原因，这项技术逐渐被16S rRNA的测序所取代。如今，基本都是使用后者进行测序。23S rRNA分子是比16S rRNA更大的信息单元，在许多情况下具有更高的系统发育重建分辨能力[22]。即便如此，由于其长度、测序不像16S那样流行，所以数据库中的23S rRNA序列的数量要少很多。

同时，16S rRNA测序的方法是微生物分类学中最广泛使用的标准技术之一。因此，可广泛访问的数据库中提供了全面的序列数据集（1999年约18000个条目）。利用这些数据进行的系统发育重建为目前细菌系统学的评价和重组以及细菌类群的修订、重新分类和重命名提供了基础。rRNA技术也被作为多相方法的一个集成部分，用于描述新的细菌种类或更高分类单元[22]基于16S rRNA的系统发育树重建与基于替代分子（如：23S rRNA、ATP酶亚基、延伸因子和RNA聚合酶）的重建的一致性已经得到测试，结果显示发育树的拓扑结构非常相似[22]。

16S rRNA分子作为系统发育推断的通用标准参数的一个重要特征是相对容易进行序列比对。比对基于序列的系统发育分析的第一个关键步骤。由于必须比较具有共同祖先的位置以获得可靠的系统发育结论，同源位置必须以正确的比对排列在共同的列中[22]。所有的rRNA分子都有一个共同的二级和更高一级结构。通过补偿碱基配对中涉及的位置的碱基变化，保持螺旋元件的保守性与初级结构保守性无关。因此，检查一次结构是否具有形成高层结构的潜力通常有助于提高一次结构的准确度。然而，总有一些可变区域是不能明确对齐的，如何对数据进行排列是研究者的主观决定[22]。

16S rRNA测序和比对分析表明，该方法具有较高的分辨能力，可以测量物种水平以上生物之间的亲缘程度。然而，随着更多的序列信息变得可用在对密切相关的生物体进行检测时，16S rRNA序列的分辨能力显然是有限的（图4）[23]。因此，不能仅仅根据rRNAs或其基因的序列相似性来定义细菌种类。由于16S rRNA在这一水平的分辨率较低，无法设定描述物种的绝对值。然而，rRNA测序方法还有其他优点，如探索未培养原核生物物种多样性，设计rRNA靶向探针，对微生物群落进行独立培养监测[24]。

图：Comparison of DNA- DNA and 16S rRNA similarities. The dataset is based on 180 values from 27 independent articles of the IJSB vol. 49(1999). These data combine intrageneric values obtained for members of Proteobacteria, Cytophaga-Flavobacterium- Bacteroides and Gram positives of high GC phyla.

2.3. 基于DNA的分型方法（DNA指纹图谱）

基于DNA的分型方法通常允许检测种内多样性，例如， 物种内的细分成许多不同的类型。 它们是对试图揭示近亲相关生物多样性的表型分析的额外支持[13]。 可以区分两种基本技术：（i）基于全基因组限制性片段分析的第一代分型方法，（ii）和基于基因组片段扩增的聚合酶链反应（PCR）方法。 这些技术都依赖于电泳分离和随后的DNA片段可视化。

利用第一代基于DNA的方法，是通过使用限制性酶产生全基因组的片段。常见的限制酶识别4 ^ 6个碱基的特定组合。由于细菌基因组的大小（在0.6和9.5兆碱基之间; [25]），用常见酶消化导致不同大小的DNA片段的复杂混合物，在大多数情况下，难以分析。然而，通过选择少量切割DNA的限制酶可以减少DNA片段的数量，识别6-8个碱基的特定组合。该技术称为LFRFA。但是，这些片段太大而不能使用常规的琼脂糖凝胶电泳进行分离，因此必须使用PFGE[13, 26, 27]就能得到每个菌株的电泳图案。通过数值分析对模式的比较，建立了物种内的相似性类群。该技术与Southern blot杂交技术相结合，可以获得基因组大小和组织的数据，未来可能与某种生物的综合描述相关。基因组中rRNA操纵子的数量和分布可能是基因组的一个简单但有用的分类特征，可以通过这种技术揭示[28]。

或者，通过常规酶的常规限制性消化产生的复杂DNA模式可以转移到膜上，然后与标记的探针杂交，其显示杂交的片段。其中一个的典型例子是核糖分型方法，它使用rRNA作为探针。

PCR方法在微生物实验室的引入，为物种分类的应用开辟了广阔的前景[13]。在此基础上，研制出了一系列不同的分型方法。介绍了在PCR测定中使用短任意序列作为引物的不同方法：在任意引物PCR中使用约20个碱基的寡核苷酸[29];大约10个碱基的寡核苷酸用于随机扩增的多态性DNA分析[30]。这些仅是将PCR应用于细菌分类的许多实例中的少数几个。但是，它们仅适用于对种内多样性。这些技术不适用于原核物种的限制以及更高的分类单元，因此它们在原核分类中的应用相当有限。

3. 原核生物的物种概念

如第1部分所述，原核生物分类学在20世纪初经历了大部分的发展。该分类系统以及Linnean命名法被用来类比已建立的真核生物系统，特别是植物学规范[31]。所采用的系统对于所有水平的细菌分类都是令人满意的。被视为抽象实体的超级类别[32]可以与为真核生物建立的分类系统进行比较。然而，原核生物物种的概念是不同的，因为没有普遍的概念存在[33]。

今天的原核生物物种概念源于对被认为是一个单位的东西的经验改进。通过微生物学方法的发展优化了物种的界限，揭示了原核生物的基因组和表型特征，但这些特征不能通过简单的观察获得。最近，原核物种的定义被一些非分类学家严厉批评为过于保守和定义不明确[34-36]。另一方面，许多其他微生物学家认为目前的概念是可以接受的[37]。我们将在下面论证，根据现有的微生物技术和信息的现状，目前的概念有缺陷，但是目前最实用的概念。它还满足了概念的几个重要要求，如产生的分类方案是稳定的、可操作的和可预测的。

4.总结

综上可知，微生物鉴定和分类的方法有很多，其中分子生物学技术的应用非常广泛且这些方法之间各有其优势与不足。在实际应用中，除了利用不同分子生物学技术外，要鉴定一个新的菌株，还要系统地从形态及生理生化特征等方面逐步进行鉴定，综合各项鉴定结果，才能确定菌株的分类归属。

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