生物制药工程中无细胞蛋白表达体系的运用

生物制药工程中无细胞蛋白表达体系的运用

刘佳璐

济宁学院 山东省济宁市 273100

摘要：随着生物技术产业的兴起，已开发出多种形式的肽，蛋白质，抗体，酶，工程融合蛋白和结合物形式的生物制药产品，用于治疗糖尿病，炎症和代谢性疾病以及各种癌症和神经系统疾病。与传统的小分子药物相比，蛋白质治疗剂的优势包括更高的活性，较低的毒性和靶向效应以及可预测的作用机制。往往疗效显著、不良反应小、安全性高，这些有利的性质使蛋白质治疗剂能够实现更高的临床试验成功率。尽管这些生物制剂在临床上有很多优势，但是这些生物制剂存在稳定性差、易被酶解、生物半衰期短等问题，故在存储，制剂和给药方面存在着一些问题，阻碍其在更广泛的在药物释放领域的应用。

关键词:生物制药工程;无细胞蛋白;表达体系;运用

引言

生物制药技术中无细胞蛋白表达体系具有很多优势，其可以大幅度提升制药行业的工作效率和工作质量。蛋白质表达体系在制药中的应用较为复杂，无细胞蛋白表达体系可以简化这个流程。相对于传统的体内表达体系，无细胞蛋白表达体系基于细胞提取物，有着不受细胞生理限制以及胞内蛋白酶降解的优势，对整体制药水平的提高具有重要的促进作用。

1角蛋白的结构

角蛋白作为一种难降解的结构蛋白，是继纤维素和几丁质之后的第三类聚合物。根据蛋白质二级结构差异可以分为α-角蛋白和β-角蛋白。一般情况下，动物毛发中的角蛋白为α-角蛋白，具有α-螺旋结构，直径为7~10nm，分子量在40~60ku，家禽羽毛、蹄和角中的角蛋白为β-角蛋白，其结构为β折叠，二硫键含量较高，直径为3~4nm，其分子质量在10~12ku。α-螺旋和β-折叠会以多种形式结合，形成角蛋白的超螺旋结构，再加上二硫键、疏水键和氢键等键的强相互作用，导致角蛋白分子结构十分稳定，不容易被降解。

2生物制剂稳定性

2.1物理稳定性

生物制剂物理不稳定会导致各种问题：变性，表面吸附，自缔合，沉淀和聚集。通常认为，蛋白质物理稳定性涉及两个关键因素，即结构和构象稳定性以及溶液能量。蛋白质天然结构是各种弱和相反作用力的结果。蛋白质的构象稳定性由氨基酸序列，溶液变量（例如pH和离子强度）以及与配体的相互作用共同决定。蛋白质物理稳定性的第二个主要因素是溶液能量，通常称为“胶体稳定性”。溶液能量学是对蛋白质-蛋白质，蛋白质-表面和蛋白质-溶剂相互作用的描述。物理不稳定性溶液条件直接影响蛋白质的结构稳定性和溶液能量。

2.2生物降解法

利用微生物产生的角蛋白酶在温和条件下对角蛋白废弃物进行处理，成为近年来一种高效、低能耗和环保的降解方式。生物降解法分为酶法和微生物降解法。酶法是利用角蛋白酶将角蛋白废弃物水解成许多短肽，得到最终产品的一种方法。该方法操作条件温和、绿色环保、产品消化率高、稳定性好，但成本较高，在实际生活中应用不广泛。微生物降解法是通过某些微生物发酵产生角蛋白酶作用于角蛋白，从而得到降解产物的方法。与物理和化学方法相比不仅反应条件温和，角蛋白的营养价值损失较小、氨基酸的利用率增高，而且不会产生大量废弃污染物。与酶法相比不仅成本低，而且还能产生多种营养物质。与理化方法相比，反应条件温和，角蛋白营养价值损失小，氨基酸利用率提高，没有产生大量的废污染物。与酶法比较不仅成本低，而且能产生多种营养。

2.3化学稳定性

多个氨基酸残基可能会发生化学修饰或破坏。化学修饰与蛋白质功能改变和物理稳定性降低有关。脱酰胺和氧化是最常见的。脱酰胺作用是一种主要发生在天冬酰胺残基上的非酶促反应。天门冬酰胺的脱酰胺修饰了侧链以产生天冬氨酸和异天冬氨酸，并且损失了氨。氧化是共价修饰，最常影响蛋氨酸残基，但所有带有芳族或含硫侧链的残基均易受影响。必须针对该蛋白质量身定制针对特定蛋白质确定的化学不稳定性的缓解策略。主要的缓解策略是确定使降解速率最小化的溶液条件（pH，缓冲液种类，离子强度，赋形剂）

3生物制药工程中无细胞蛋白表达体系的运用

3.1引入非天然氨基酸

氨基酸对生物制药的质量有着非常重要的影响。氨基酸的数量和质量可以决定药物中各分子比例结构，比例不符合药物需求，会导致药物质量不达标。在以往的药物生产中，天然氨基酸占有比较大的比例，但是天然氨基酸对抑制性TＲNA识别特定终止密码子的氨酰化效果不佳，容易造成比例失调现象，这会严重影响药物质量。无细胞蛋白表达系统在生物制药中的运用可以改善这个问题。通过该体系可以大量引入非天然氨基酸，经过人工培育的氨基酸可以有效抑制TＲNA识别特定终止密码子的氨酰化，保证药物质量的可靠性。现阶段的研究中，通过在无细胞蛋白表达体系中添加非天然氨基酸底物，建立了高效便捷的反应体系，能够对目标蛋白进行选择性修饰。

3.2丝素蛋白对蛋白生物试剂控释的应用

丝素蛋白已被证明对于蛋白制剂的活性具有一定的保护作用。故可作为蛋白类生物制剂的载体。而蛋白类生物制剂的释放机制主要分为扩散、溶胀和降解这三种。丝素蛋白的二级结构和性能可控，导致了可控的降解速度以及可控制的药物释放速率。这使得丝素蛋白在生物制剂的药物输送系统中具有很大的吸引力。Wang等将辣根过氧化物酶（HRP）和牛血清白蛋白（RhBSA）作为模型蛋白药物被包裹在含有和不含有丝素蛋白涂层的PLGA和藻酸盐微球中。与未涂覆的微球对照相比，该丝素涂层显着延迟了药物释放。PLGA和藻酸盐微球上的丝素涂层提供了机械稳定的外壳以及对包封的蛋白药物的扩散屏障。用丝素蛋白包被微球可以改善生物相容性。除了用于药物递送的包衣以外，包衣还有益于酶改善稳定性和选择性。丝膜中辣根过氧化物酶（HRP）的稳定和释放。

3.3角蛋白酶在洗涤剂中的应用

研究表明，角蛋白酶具有使洗涤剂稳定的特性以及对不同污渍具有清洁能力。BacillusaeriusNSMk2所产的角蛋白酶显示出对盐度的出色稳定性，并且被发现与大多数商业洗涤剂兼容，可以有效去除衣服上的巧克力，血液和蛋清蛋白污渍。芽孢杆菌TKB2产生的角蛋白酶作为添加剂加入到洗涤剂中，可提高其去污能力，并且不会破坏衣物，产生的洗涤废水不会污染环境。除了用于洗涤剂外，角蛋白酶还用做排水沟清洁剂中的添加剂。角蛋白酶除了用于清洁剂外，还用作下水道清洁剂中的添加剂。含磷洗涤剂废水流入河道，导致水体磷含量增加，水质富营养化，藻类大量生长，破坏正常生态平衡。因此，使用含角蛋白酶的洗涤剂，对环境影响小，效率高，是未来的发展趋势。

结束语

无细胞蛋白表达体系已经被广泛应用在生物制药工程中，无细胞蛋白表达技术也越来越成熟，已经从原核系统发展到真核系统，研究深度得到了很大提升，对生物制药产业有很大的帮助。无细胞蛋白表达技术的有效应用可以节省下游处理环节，降低制药成本。此外，它还具有相对稳定的特点，对于有用物质的提取比较方便，可以简化制药流程。无细胞蛋白表达体系具有一定的优势，具有广阔的发展前景。

参考文献

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