荧光定量RT-PCR在流感病毒检测上的应用研究

荧光定量 RT-PCR在流感病毒检测上的应用研究

蒋琳

黔西南州疾病预防控制中心， 贵州黔西南 562400

【摘要】目的：分析荧光定量RT-PCR在流感病毒检测上的应用价值。方法：对23例确诊感染乙型流感病毒的咽拭子、相关机构提供的甲型流感病毒及乙型流感病毒进行检测分析，使用荧光定量RT-PCR检测，分析临床应用的价值及检测的准确率。结果：荧光定量RT-PCR检测乙型流感病毒呈阳性，且结果与其他病毒未见交叉情况。荧光定量RT-PCR检测不同浓度乙型流感病毒敏感度较高，检测的准确率是86.96%（20/23）。结论：荧光定量RT-PCR检测流感病毒的敏感度、准确性较高，可以作为疾病筛查的依据，建议推广应用。

【关键词】荧光定量RT-PCR；流感病毒检测；敏感度

流感是常见的疾病类型，春季、秋季发生率较高，疾病易于传染，影响公共卫生安全。流感病原菌类型具有多样化特征，病毒检测的方式将会直接影响检测的结果^[1]。乙型流感传播范围较广、传播速度较快，与甲型流感病毒相似。加强乙型流感病毒的致病菌、特征分析，对病毒的控制与治疗能够产生重要影响，可预防疾病的传播。根据乙型流感病毒的特征，当前临床应用RT-PCR检测较多，但是检测效果不够理想。随着现代医疗事业的发展，荧光定量RT-PCR逐渐在临床中得到应用。文章主要以对比检测的方式，评估荧光定量RT-PCR的临床检测价值，报道结果如下。

1资料与方法

1.1基础资料

将2019年1月至2019年12月实验室检验确诊的23例乙型流感病毒咽拭子进行检测研究，均通过血清学检测确诊为乙型流感病毒。应用北京生物制品研究所供应的甲型流感病毒（H1与H3），呼吸道合胞病毒及乙型流感病毒。使用效价滴定的MDCK细胞。引物是乙型流感病毒核酸基因NP保守序列，仅具有一级结构，碱基数量＜20个，引物之间无互补关系。探针5’端鉴别FAM，3’端鉴别RAMRA。

1.2检测方式

应用MDCK细胞对乙型流感病毒实施效价滴定处理，制作为10.00、1.00、0.10及0.01浓度的CTID50/管，以备实验应用。采用RT-PCR试剂盒，实施逆转录、扩增处理，35次循环后取物，对特异性条带状态予以记录。使用荧光定量RT-PCR检测，甲型流感病毒、乙型流感病毒及呼吸道合胞病毒，对差异性浓度的乙型流感病毒制剂予以分别检测。将确诊感染的咽拭子实施荧光定量RT-PCR检测，将检测结果与血清学检测结果比较。

1.3评价指标

记录荧光定量RT-PCR检测不同浓度乙型流感病毒的敏感度，临床检测的准确率。

2结果

2.1荧光定量RT-PCR检测的敏感度

荧光定量RT-PCR检测乙型流感病毒呈阳性，且结果与其他病毒未见交叉情况。荧光定量RT-PCR检测不同浓度乙型流感病毒敏感度较高，可清晰可见实验变化。详见表1

表1 荧光定量RT-PCR检测的敏感度比较

2.2荧光定量RT-PCR检测的准确率

荧光定量RT-PCR检测中，检出20例，漏检3例，临床检测的准确率是86.96%。

3讨论

流感病毒为流感形成的致病体，包含多种类型，其中甲型流感病毒较为常见^[2]。甲型流感与乙型流感病毒的结构类似，临床表现也比较相似，但是乙型流感病毒的大量传播则比较少见，临床易于出现误诊的情况。

流感病毒检测的方式较多，血清学检测的应用范围较广。但是血清学检测方式，需要在病患体内病毒聚集到一定程度后方可检出^[3]。常规RT-PCR检测主要是在乙型流感病毒中抽取一段，实施逆转录与扩增操作，获得特异性片段，评价是否感染病毒^[4]。相较于常规的检查方式，其敏感度与准确率显著提升，可缩短检测的消耗时长。但是在临床应用RT-PCR检测的过程中，假阳性的问题时常发生。分析原因，可能与扩增期间其他病毒感染密切相关^[5]。

流感病毒主要包含胞膜、基质蛋白及核心，病毒差异突出表现在核心方面^[6]。荧光定量RT-PCR检测只要是结合乙型流感病毒的核算特异序列进行分析，将特异序列视为引物，以5’端识别FAM，3’端识别TAMRA，预防与其他病毒交叉感染的问题发生，可提升临床检测的准确率。荧光定量RT-PCR检测，对乙型流感病毒核酸具有较强的特异反应，反应与其他病毒间不会交叉存在，比如呼吸道合胞病毒、禽流感病毒及甲型流感病毒等。本次研究结果显示，荧光定量RT-PCR检测乙型流感病毒呈阳性，且结果与其他病毒未见交叉情况。荧光定量RT-PCR检测的准确率是86.96%，临床检测的准确率相对较高，可以作为临床疾病筛查的方式之一。

荧光定量RT-PCR检测流感病毒，可以在全面封闭的试管中操作，其扩增期间受到污染的可能性较低，进而可控制假阳性的发生率。乙型流感病毒浓度0.01TCID50/管的情况下，病毒临床检测依然具有较高的敏感度，体现出荧光定量RT-PCR检测的价值。相较于常规的RT-PCR检测方式，荧光定量RT-PCR检测方法敏感度、准确率可有效提升。在流感病毒检测的过程中，可减少材料浪费问题的发生率。检测操作规范、环保，不会产生影响环境的有害物质，适合于在检测中使用。

荧光定量RT-PCR检测的速度较快，可在3-4h内快速获得检测结果，对样本的要求相对较低，灵敏度较高，且能够在临床诊断及疫情爆发的情况下，快速检测使用。随着现代医学的快速发展，当前越来越多的医学研究者认为荧光定量RT-PCR检测可以作为流感病毒检测的“金标准”，也证实了其临床检测应用价值。在未来的临床医学研究中，还需要进一步拓展样本数量，综合分析荧光定量RT-PCR检测的应用价值，提升流感病毒检测的准确率、及时性，预防流感病毒的蔓延，保证公共卫生安全。

综上报道，荧光定量RT-PCR检测流感病毒的敏感度、准确性较高，可以作为疾病筛查的依据，建议推广应用。

参考文献

[1]赖丽金,李阿茜,张全福,等.寨卡病毒、基孔肯雅病毒和马雅罗病毒三重实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立[J].中华实验和临床病毒学杂志,2019(06):632-636.

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[3]高洁,严敏,付婷,等.TapMan荧光定量RT-PCR快速检测乙型流感病毒核酸方法的建立及意义[J].中国现代药物应用,2018,12(11):52-53.

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[5]魏斌,田一男,李平,等.犬瘟热病毒原液TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立[J].浙江农业学报,2017,29(11):1819-1826.

[6]陈勉乔,于浩洋.禽流感病毒H7N9型实时荧光定量RT-PCR检测方法的研究[J].现代检验医学杂志,2016,31(03):48-50+54.

作者简介：蒋琳（1985.11-），女，苗族，贵州兴义人，本科学历，主管技师，主要从事微生物检验。